Desarrollo de inmunoterapia con virus de ARN sintético administrado por vía intravenosa para el tratamiento del cáncer

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5907 (2022) Citar este artículo

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La eficacia terapéutica de los virus oncolíticos (OV) administrados por vía intravenosa está limitada por el desarrollo de respuestas de anticuerpos neutralizantes contra el virus. Para eludir esta limitación y permitir la administración sistémica repetida de OV, aquí desarrollamos virus de ARN sintético que consisten en un genoma de ARN viral (ARNv) formulado dentro de nanopartículas lipídicas. Para dos candidatos a fármacos de virus de ARN sintético, el virus Seneca Valley (SVV) y el Coxsackievirus A21, demostramos la entrega y replicación de ARNv, el ensamblaje del virus, la propagación y la lisis de las células tumorales que conducen a una potente eficacia antitumoral, incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes de OV en el torrente sanguíneo. La replicación de SVV sintético en tumores promueve la infiltración de células inmunitarias, la remodelación del microambiente tumoral y mejora la actividad del inhibidor del punto de control anti-PD-1. En ratones y primates no humanos, el SVV sintético se tolera bien y alcanza una exposición muy por encima del requisito de actividad antitumoral. En conjunto, la plataforma de virus de ARN sintético proporciona un enfoque que permite la administración intravenosa repetida de inmunoterapia viral.

Los virus oncolíticos (OV) son una atractiva modalidad terapéutica contra el cáncer que mata selectivamente las células tumorales e inflama el microambiente tumoral (TME). La combinación de OV con inmunoterapias contra el cáncer tiene el potencial de promover la remodelación del TME y la activación de las células inmunitarias, lo que mejora el beneficio de los inhibidores del punto de control inmunitario (ICI) en tumores que responden mal o no. Hasta el momento, el beneficio terapéutico de la viroterapia oncolítica se ha limitado a la administración intratumoral que requiere una respuesta inmune antitumoral sistémica para ser eficaz contra las lesiones no inyectadas. Talimogene laherparepvec (Imlygic®)1 ha demostrado respuestas duraderas en pacientes con melanoma cuando se administra por vía intratumoral, al igual que el virus Coxsackie A21 (CAVATAK®)2. La administración intravenosa (IV) de OV puede mejorar la eficacia al exponer todos los sitios del tumor, incluidas las lesiones metastásicas pequeñas, a los OV. Sin embargo, es probable que el rápido desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra el virus después de la administración IV limite la exposición y la infección de las células tumorales después de dosis repetidas3,4.

Para maximizar el potencial de la inmunoterapia viral, se deben desarrollar estrategias para evitar la neutralización. La reorientación5,6, los portadores de células7,8, el recubrimiento con polímeros9,10,11 y los liposomas12,13 se han utilizado para proteger a los OV de los anticuerpos neutralizantes, pero ninguno ha llegado a la clínica. Los avances en nanotecnología y su uso para administrar ácidos nucleicos están allanando el camino para que los nuevos sistemas de transporte superen los desafíos de la administración IV de OV14,15.

Aquí, describimos el desarrollo de una plataforma de administración basada en nanopartículas que permite la administración IV repetida de inmunoterapias virales. Las plantillas de plásmido están diseñadas y optimizadas para la transcripción in vitro (IVT) de genomas de virus de ARN (ARNv) que, tras la formulación en nanopartículas lipídicas (LNP), generan partículas con las propiedades biofísicas deseadas para respaldar la administración IV repetida. Como todos los componentes son sintéticos; denominamos a esta modalidad virus de ARN sintético.

Para este estudio, seleccionamos dos picornavirus, Seneca Valley virus (SVV) y Coxsackievirus A21 (CVA21), con actividad oncolítica y seguridad clínica bien documentadas2,16,17,18,19. Sus genomas son ARN monocatenario de sentido positivo y son suficientes para iniciar el ciclo de vida viral después de ser introducidos en una célula tumoral permisiva. Este estudio informa sobre la entrega y replicación de vRNA de Synthetic-SVV y Synthetic-CVA21. Mostramos que los virus sintéticos son bien tolerados y demuestran la producción viral selectiva de tumores y la propagación en múltiples modelos de tumores, lo que resulta en oncólisis y eficacia antitumoral. Anticipamos que esta plataforma terapéutica abordará las limitaciones asociadas con la administración IV repetida y mejorará el potencial terapéutico de los OV.

Para eludir los anticuerpos neutralizantes que inhiben la actividad de los OV administrados por vía intravenosa, desarrollamos virus de ARN sintético para la administración sistémica de ARNv a las células tumorales. Una vez que el ARNv/LNP se internaliza y se libera en el citoplasma de una célula tumoral, el ARNv se replica y genera una explosión de viriones infecciosos que se propagan localmente, destruyendo las células tumorales adyacentes y esto promueve el reclutamiento de células inmunitarias al TME (Fig. 1 ). Las construcciones de vRNA picornaviral SVV y CVA21 se validaron in vitro e in vivo por su capacidad para producir virus (Figs. 1 y 2 complementarias). Luego optimizamos una formulación de LNP para administración IV con las propiedades biofísicas deseadas: tamaño pequeño (85 nm), monodisperso y alta eficiencia de encapsulación (Fig. 3a complementaria).

El virus de ARN sintético se compone de ARNv producido por IVT encapsulado dentro de un LNP. Dentro de las células tumorales, el ARNv recapitula todas las fases del ciclo de vida viral de modo que se replica y genera una explosión de viriones infecciosos que se propagan localmente, infectando y matando células tumorales, reclutando así células inmunitarias para el TME.

Para garantizar que la replicación del ARNv se inicie después de la traducción de la poliproteína, los extremos del ARNv de IVT deben recapitular los del genoma viral de ARN. Estos términos se generan durante la IVT mediante una ribozima 5' optimizada y una plantilla de escorrentía producida por escisión por una enzima de restricción de tipo IIS en los extremos 3'. Para mejorar la potencia de Synthetic-SVV, introdujimos modificaciones en el sitio de entrada interno del ribosoma (IRES)20 y una mutación en VP2 que mejora la entrada viral21. Estas modificaciones mejoraron su eficacia en comparación con el SVV-001 vRNA22 (Figura complementaria 3b, c). Al final del estudio, se detectó la replicación de SVV en células tumorales y no en tejido hepático (Fig. 3d complementaria), lo que indica que la distribución sistémica de vRNA/LNP condujo a la replicación viral en células tumorales permisivas y no en tejidos sanos.

La administración de SVV sintética dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral (TGI) de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) NCI-H446 (Fig. 2a), incluida la regresión de tumores muy grandes (> 500 mm3, Fig. 4a complementaria) sin cuerpo significativo pérdida de peso (Fig. 2b). La administración de Synthetic-SVV-Neg (un ARNv incompetente para la replicación) no inhibió el crecimiento tumoral (Fig. 2a), lo que demuestra que TGI está asociado con la replicación de SVV. Tres días después de la inyección IV de viriones de SVV sintético o SVV como control positivo, se detectó una señal robusta de hibridación in situ fluorescente (FISH) en el tumor de las cadenas de ARN de sentido positivo y negativo (Figura complementaria 4b). La detección de ARN de cadena negativa, una plantilla para el genoma de ARN de cadena positiva de picornavirus, confirma inequívocamente la replicación del ARN viral. En tumores de ratones que recibieron dosis de Synthetic-SVV-Neg no replicante, solo se detectaron niveles bajos de ARN de cadena positiva, probablemente asociados con ARNv/LNP residual en los vasos sanguíneos (Fig. 4b complementaria).

a-d Ratones desnudos atímicos implantados por vía subcutánea con tumores de xenoinjerto SCLC NCI-H446. a, b Los ratones se trataron mediante administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV los días 1, 8 y 15, a 1,0 mg/kg (n = 8 por grupo). Se controlaron el volumen del tumor (mm3) y los cambios en el peso corporal (%). Se controlaron el crecimiento tumoral (mm3) y los cambios de peso corporal (%). Los datos se presentan como media ± sem. La significación estadística se determinó mediante un modelo lineal mixto ***p < 0,001 frente a PBS y ^^^p < 0,001 frente a Synthetic-SVV-Neg. c, d Replicación de Synthetic-SVV en tumores NCI-H446 después de una única dosis IV de 0,1 mg/kg de SVV. c Los niveles de ARN de cadena negativa de SVV se determinaron mediante RT-qPCR (n = 5 por punto de tiempo). Las partículas de infección por SVV (PFU) se determinaron mediante un ensayo de placa. Se evaluaron n = 3 muestras de tumores independientes por punto de tiempo. d FISH específico para las cadenas de ARN positivas (rojas) y negativas (blancas) de SVV se muestran para las secciones del tumor NCI-H466. Los núcleos se marcaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estas imágenes son representativas de cuatro muestras independientes. La escala del panel se indica debajo de la imagen. e, f Ratones desnudos atímicos (n = 7 por grupo) implantados por vía subcutánea con tumores de melanoma humano SK-MEL-28 fueron tratados mediante administración IV con control de vehículo (PBS) o Synthetic-CVA21 en los días 1 y 8 en 2 dosis diferentes, 0,2 mg/kg o 0,05 mg/kg. Se controlaron el crecimiento tumoral (mm3) y los cambios de peso corporal (%). Los datos se informan como media ± sem. La significación estadística se determinó mediante un modelo lineal mixto ***p < 0,001 frente a PBS. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explorar la relación dosis-respuesta después de la administración IV de Synthetic-SVV, realizamos una titulación de dosis. Se observó una TGI potente de tumores de xenoinjerto NCI-H466 en todos los niveles de dosis, con una TGI máxima alcanzada con 0,1 mg/kg o más (Fig. 4c complementaria). Por tanto, se seleccionó una dosis de 0,1 mg/kg para caracterizar la cinética de replicación viral. Después de una sola administración IV de Synthetic-SVV, los tumores se recolectaron en múltiples puntos de tiempo y se analizaron mediante RT-qPCR y FISH. El ARN viral de cadena negativa y los viriones intratumorales se detectaron a los 3 días y alcanzaron una meseta en la mayoría de los tumores a los 7 días posteriores al tratamiento. Sorprendentemente, se detectó una replicación sostenida de SVV hasta 21 días después de administrar una única dosis baja de Synthetic-SVV (Fig. 2c). Estos hallazgos se recapitularon en gran medida con la detección FISH de cadenas de ARN positivas y negativas de SVV, con la señal FISH ampliamente distribuida en el tumor y alcanzando su punto máximo el día 10 (Fig. 2d).

CVA21 fue seleccionado como segundo candidato a virus de ARN sintético, en función de sus propiedades oncolíticas, tolerabilidad intravenosa favorable en pacientes con cáncer2,23,24 y tropismo tumoral distinto en comparación con SVV16,24. El ARNv transcrito de CVA21 IVT formulado con la misma composición de lípidos que se utilizó para el SVV sintético produjo nanopartículas con propiedades biofísicas igualmente deseables. Se observó regresión tumoral completa a niveles de dosis bajos en el modelo de melanoma SK-MEL-28 (Fig. 2e), sin pérdida significativa de peso corporal (Fig. 2f).

La tolerabilidad del virus sintético-SVV se evaluó en ratones inmunocompetentes A/J tolerantes a la infección por SVV22. La administración intravenosa de Synthetic-SVV a 3 mg/kg fue bien tolerada cuando se administró a ratones A/J con tumores de neuroblastoma singénico, N1E-11525. No se observaron cambios adversos significativos en el peso corporal, signos clínicos o hallazgos histopatológicos (Fig. 5a complementaria). La cuantificación de OC por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) mostró una amplia distribución de LNP en todos los tejidos analizados 30 minutos después de la dosis (Fig. 5b complementaria), seguida de una eliminación rápida como lo demuestra la falta de detección de OC a las 24 horas. No hubo cambios en la química clínica, incluida la función hepática (Figura complementaria 5c-e). Se observó una elevación transitoria de citoquinas proinflamatorias (Fig. 5f-j complementaria), como se informó para otros LNP administrados sistémicamente26, pero no estuvo acompañada de activación del complemento (Fig. 5k complementaria). En ratones A/J ingenuos, Synthetic-SVV mostró una replicación viral mínima y transitoria en pulmón, bazo e hígado (Fig. 5l complementaria).

El CVA21 sintético también fue bien tolerado en un ratón transgénico que expresa el gen ICAM1 humano (huICAM1), el receptor celular para CVA21, y se sabe que es sensible a la infección por CVA2127,28. La administración IV de Synthetic-CVA21 no provocó ningún signo clínico adverso (Fig. 6a complementaria). Los hallazgos histopatológicos se limitaron a cambios microscópicos leves en el hígado, atribuidos principalmente al tratamiento con la formulación de LNP. Se detectaron niveles bajos de replicación de CVA21 por RT-qPCR y por ensayo de título de placa en el bazo, hígado, pulmón, corazón y riñón 2 días después de la dosificación. Sin embargo, el ARN de cadena negativa o los viriones CVA21 fueron indetectables a los 7 días (Fig. 6b, c complementarias), lo que indica que los ratones habían eliminado la infección por CVA21. Estos datos sugieren que Synthetic-SVV y -CVA21 son bien tolerados en modelos de ratones que se sabe que son permisivos con estos virus a niveles de dosis superiores a los necesarios para provocar la regresión del tumor.

La tolerabilidad de Synthetic-SVV se evaluó adicionalmente en primates no humanos (NHP) dosificados tres veces cada dos semanas con 1 mg/kg de Synthetic-SVV. No se observaron signos clínicos, se observaron efectos significativos en los pesos corporales (Fig. 7a complementaria). El análisis farmacocinético del componente lipídico LNP indicó que la exposición (AUC0-∞) alcanzada en el plasma NHP fue 85 veces superior a la exposición lograda en ratones desnudos atímicos que recibieron la dosis máximamente eficaz en el modelo SCLC NCI-H446 (Figura complementaria 4a y Tabla 1). La administración sistémica de Synthetic-SVV distribuyó el ARNv a todos los tejidos examinados, incluidos el bazo, el hígado, los riñones, los músculos, los pulmones y el cerebro, 24 h después de la tercera dosis (Fig. 7b complementaria), lo que refleja la amplia biodistribución del lípido LNP. componente observado en ratones portadores de tumores (Fig. 5b complementaria).

Además, no se observaron hallazgos histológicos en NHP. Solo se observó una elevación menor y transitoria de los parámetros químicos hepáticos (Fig. 7c-e complementaria). Las citocinas proinflamatorias plasmáticas, incluidas IL-6 y MCP-1 y la actividad del complemento, aumentaron transitoriamente dentro de las 2 a 24 h posteriores a la dosis intravenosa (Fig. 7f-h complementaria). Estos resultados demuestran la tolerabilidad de dosis repetidas de Synthetic-SVV en monos cynomolgus a un nivel de dosis que supera las exposiciones necesarias para provocar una potente actividad antitumoral.

Postulamos que la entrega de vRNA/LNP sería resistente a los anticuerpos neutralizantes de virus en circulación. Para probar esta hipótesis, inmunizamos pasivamente ratones inmunodeficientes portadores de NCI-H466 con un suero de conejo de control o un suero anti-SVV de conejo con potencia de neutralización confirmada para SVV-001, SVV (S177A) y SVV (S177A-IRES2). ) virus, este último codificado por el vRNA en Synthetic-SVV (Figura complementaria 8a-c). Luego comparamos la eficacia antitumoral de 0,1 mg/kg de viriones de SVV sintético o SVV (S177A-IRES2) (Fig. 3). Los animales tratados con suero de control que recibieron una dosis de SVV (S177A-IRES2) o SVV sintético exhibieron una potente actividad antitumoral en relación con el control del vehículo. Por el contrario, en ratones pretratados con suero anti-SVV, la eficacia del SVV (S177A-IRES2) administrado por vía IV se anuló por completo, mientras que el Synthetic-SVV siguió siendo potente para inhibir el crecimiento de los xenoinjertos NCI-H466. Se observó una anulación similar de la actividad del SVV-001 clínicamente evaluado en presencia de anticuerpos neutralizantes, mientras que el Synthetic-SVV permaneció activo (Fig. 8d complementaria)

La eficacia antitumoral del virus derivado de SVV sintético SVV (S177A-IRES2) y el SVV sintético según lo evaluado por el volumen del tumor (mm3) se evaluó en ratones portadores de tumores NCI-H446 después de la inyección de suero de conejo anti-SVV de control o neutralizante. Los ratones que se inmunizaron pasivamente con antisueros de SVV recibieron 3 inyecciones IV de 106 UFP de viriones de SVV (S177A-IRES2) o 0,1 mg/kg de SVV sintético (n = 10 por grupo). Los datos se presentan como valores medios +/− SEM. La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto. p < 0,001 frente a PBS, SVV(S177A-IRES2) y Control Ab. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego buscamos evaluar la actividad de Synthetic-SVV en modelos que pueden ser más representativos de SCLC humano que los modelos de xenoinjerto subcutáneo. SCLC es una indicación apropiada para el desarrollo clínico de Synthetic-SVV, dado que SVV tiene un tropismo establecido para tumores de origen neuroendocrino16,22. En ratones con tumores NCI-H82 implementados ortotópicamente en el pulmón, dos administraciones IV de Synthetic-SVV desencadenaron la replicación de SVV (Figura complementaria 9a) y casi duplicaron la supervivencia frente a los brazos de control (Figura 4a). Se utilizó inmunohistoquímica (IHC) para el ligando 3 similar a Delta humano (hDLL3), un marcador neuroendocrino altamente expresado en células NCI-H82 (Fig. 9b complementaria), para cuantificar la carga tumoral. La evaluación de los tejidos recolectados 10 días después del tratamiento reveló una reducción significativa de la carga tumoral y una extensa necrosis tumoral central en el pulmón de los ratones tratados con Synthetic-SVV (Fig. 4b, c).

Los tumores a–c NCI-H82 se implantaron ortotópicamente en ratones desnudos atímicos. Los animales recibieron dosis de PBS, 1,0 mg/kg de SVV sintético-Neg o 1,0 mg/kg de SVV sintético los días 15 y 22 después de la inoculación del tumor (n = 15 por grupo). a El análisis de supervivencia se evaluó mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox), ***p = 0,003; ****p < 0,0001 frente a SVV sintética. b Análisis morfométrico del área positiva de hDLL3 de tejido pulmonar y extrapulmonar ocupado por tumor viable en pulmones recogidos de ratones 10 días después del tratamiento. La significación estadística se determinó utilizando la prueba T pareada de dos colas, *p = 0,011; ***p = 0,0003. c Imágenes representativas de la tinción de hDLL3 según lo determinado en 15 muestras individuales/brazo de tratamiento. Las barras de escala en la parte superior izquierda son 1000 µm. d A ratones NOD/SCID se les implantaron por vía subcutánea tumores SCLC PDX (Crown Bioscience, San Diego, CA) y se dosificaron mediante administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV 1 mg/kg los días 1 y 8 (n = 8 por grupo). El volumen del tumor (mm3) se controló en varios puntos de tiempo. Los ratones e RPM se implantaron por vía subcutánea con células de cultivo primario SCLC GEMM y se dosificaron por administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV 1 mg/kg los días 1 y 8 (n = 8 por grupo ). El volumen del tumor (mm3) se controló en varios puntos de tiempo. d, e Los datos se presentan como valores medios +/− SD. La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto, ***p < 0,001 frente a PBS y ^^p < 0,01; ^^^p < 0.001 vs. Sintético-SVV-Neg. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se cree que el xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) representan mejor la heterogeneidad y la alteración genética de los cánceres humanos29. Dado que SCLC es conocido por su heterogeneidad que conduce a la aparición de enfermedad resistente al tratamiento y recurrencia30,31,32, evaluamos la capacidad de Synthetic-SVV para replicarse en un modelo SCLC PDX. A los ratones que portaban un modelo SCLC-PDX se les dosificó IV con Synthetic-SVV, Synthetic-SVV-Neg o vehículo e intratumoralmente con viriones SVV-001 como control positivo. Se observaron niveles similares de replicación viral cuando el Synthetic-SVV se administró sistémicamente, o los viriones SVV-001 se dosificaron intratumoralmente (Fig. 9c complementaria). Además, se observó una potente actividad antitumoral después de la administración de Synthetic-SVV (Fig. 4d).

Los tumores que surgen de los GEMM imitan de cerca las características moleculares, la heterogeneidad del tumor y la histopatología de sus contrapartes humanas. Evaluamos la eficacia de Synthetic-SVV en un modelo GEMM de SCLC trasplantable33 (Rb1fl/flTrp53 fl/flMyc LSL/LSL) con perfiles histopatológicos y transcripcionales similares al SCLC humano. El SVV sintético inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 4e). Los tumores recolectados 5 días después de la dosificación demostraron un alto nivel de replicación de SVV (Fig. 9d complementaria). Además, perfilamos los cambios en el microambiente inmunitario en este modelo mediante el panel Nanostring PanCancer IO 360™. Observamos un aumento notable de las puntuaciones asociadas con la citotoxicidad, la señalización del interferón y las vías del compartimento linfoide en tumores de ratones tratados con Synthetic-SVV frente al control del vehículo (Fig. 9e complementaria), lo que indica que la replicación in situ de SVV condujo a una TME más inflamada.

El cambio en el TME provocado por Synthetic-SVV se caracterizó en el tumor singénico N1E-115, un modelo pobremente infiltrado por células inmunes (Fig. 10 complementaria). La administración de Synthetic-SVV condujo a un aumento significativo en el reclutamiento de células T CD8 y una tendencia para las células T CD4 y las células NK (Fig. 5a y Fig. 11a complementaria). El número de células T reguladoras (Treg) no aumentó en los tumores, lo que llevó a una proporción elevada de CD8/Treg que se ha asociado con un beneficio clínico mejorado con la terapia anti-PD-134 (Fig. 5b). Las células T CD8 mostraron un fenotipo activado, con CTLA4 y PD-1 regulados al alza (Fig. 5c). Tanto las células efectoras de vida corta (SLEC, CD8+, CD127, KLRG1+) como las células efectoras precursoras de la memoria (MPEC, CD8+, CD127+, KLRG1-) aumentaron con el Synthetic-SVV en comparación con el control (Fig. 5d). También se perfilaron los macrófagos asociados al tumor y se observó un aumento de la relación M1 (fagocítica, CD206-CD86+)/M2 (proinflamatoria, CD206+CD86−) (Fig. 5e y Fig. 11b complementaria). El número de macrófagos M1 (Fig. 5f) y células tumorales que expresan el ligando PD-1 (PD-L1) también aumentó significativamente (Fig. 5g). Se obtuvieron resultados concordantes cuando los tumores se analizaron con el panel NanoString PanCancer IO 360™ (Datos complementarios 1). El tratamiento con SVV sintético aumentó significativamente las vías asociadas con el reclutamiento y la activación de células inmunitarias (Fig. 12 complementaria). Estos datos indican que el Synthetic-SVV promueve el reclutamiento de células inmunitarias y la inmunidad antitumoral. Además, dos dosis semanales de Synthetic-SVV condujeron a una TGI significativa (Fig. 13 complementaria).

Ratones a-g A/J (n = 5 por grupo) implantados por vía subcutánea con tumores neuroendocrinos N1E-115 singénicos. Los ratones se trataron mediante administración IV con control de vehículo PBS o 1 mg/kg de SVV sintético los días 1 y 8. Los tumores se recogieron 6 días después de la segunda dosis. a Número de células NK, NKT, CD4, CD8 y Treg por mg de tumor. Para CD8 p = 0,0002 con una prueba de ANOVA de dos vías b relación CD8/Treg. c Número de células T CD8 por mg de tumor que expresan CTLA-4 o PD-1. Para PD1 p = 0,01 con una prueba ANOVA de dos vías. d Número de células T CD8 por mg de tumor que son SLEC (CD127-KLRG1+) o MPEC (CD127+-KLRG1−). e Relación de macrófagos M1/M2. p = 0,0002 con una prueba T de Student pareada de dos colas. f Número de macrófagos M1 y M2 PD-L1+ por mg de tumor. p = 0,01 con una prueba T de Student pareada de dos colas. g Número de células CD45-PD-L1+ por mg de tumor. p = 0,01 con una prueba T de Student pareada de dos colas. Se implantaron tumores N1E-115 por vía subcutánea en ratones h A/J (n = 10 por grupo) y se trataron mediante administración IV con Synthetic-SVV los días 1 y 8 (0,3 mg/kg), y anticuerpo de control de administración IP (ratón IgG2a ) o anticuerpo anti-PD-1 en los días 1, 4 y 7 (200 µg) como se indica. Se controló el volumen tumoral (mm3). Los datos se informan como media ± sem. La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto, *p = 0,01vs. IgG2a, *p = 0,03 frente a SVV sintético/IgG2a. h Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El aumento de la inflamación en el TME y la regulación positiva de PD-L1 en las células tumorales N1E-115 y los macrófagos asociados a tumores proporcionaron una sólida justificación para combinar Synthetic-SVV con un antagonista de PD-1. Sorprendentemente para este modelo de tumor frío, el anticuerpo anti-PD-1 produjo un TGI modesto pero significativo, similar a una dosis subóptima de Synthetic-SVV; sin embargo, su combinación proporcionó una eficacia significativamente superior a la de cada agente individual (Fig. 5h).

Este informe describe el diseño y desarrollo de virus de ARN sintético para el tratamiento sistémico del cáncer. La administración intravenosa de los genomas de ARNv para dos picornavirus, SVV y CVA21, formulados en LNP, se toleró bien y provocó la producción in situ específica de tumores de OV, el reclutamiento de células inmunitarias y, en última instancia, la destrucción del tumor. Se observó eficacia en múltiples modelos de cáncer, incluidos xenoinjertos, PDX, GEMM y modelos singénicos. Además, se observó un beneficio de supervivencia en un modelo de tumor SCLC ortotópico. El SVV sintético siguió siendo eficaz incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes específicos del virus circulantes y se potenció aún más mediante la combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario PD-1.

Los OV en etapa clínica, incluidos aquellos con poca o ninguna exposición previa en humanos, como SVV, CVA21 o enadenotucirev, un adenovirus que no se produce de forma natural, han informado neutralización después de dosis IV repetidas, lo que probablemente limita la ventana de efectividad a un período de tiempo corto16, 17,23,35,36. Mostramos aquí que, en contraste con la actividad in vivo de los viriones de SVV, la actividad de Synthetic-SVV se mantuvo potente incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes de SVV. Si bien ambos tratamientos utilizan el mismo genoma viral, es importante reconocer que la modalidad de virus sintético difiere significativamente de su padre picornaviral con respecto a la estabilidad, la biodistribución, el escape endosomal y el tropismo de entrada inicial; y, sin embargo, la dosis de Synthetic-SVV administrada al tumor fue todavía suficiente para provocar una fuerte eficacia antitumoral en presencia de antisueros neutralizantes. Presumimos que una vez que se entrega el genoma viral y se inicia la replicación en las células tumorales permisivas, la concentración de anticuerpos en el medio tumoral intersticial no alcanza el umbral requerido para inhibir la propagación de célula a célula durante la infección viral. Estos datos están en consonancia con la falta de impacto de la preinmunización sobre la actividad preclínica y clínica del VHS oncolítico después de la inyección intratumoral1,37. Por lo tanto, se prevé que nuestra estrategia supere el desafío central en el campo de los OV al permitir la administración IV repetida, brindando así una oportunidad para que todas las lesiones tumorales dentro de un paciente estén expuestas al agente terapéutico mientras evaden la neutralización. Por último, esperamos que la administración sistémica de virus de ARN sintético beneficie a los pacientes con enfermedad diseminada y a los pacientes para los que es difícil realizar inyecciones de OV intralesionales seguras repetidas. El tratamiento del cáncer de pulmón es particularmente interesante en este sentido ya que los dos virus de ARN sintético que describimos aquí, SVV y CVA21, tienen tropismo por SCLC y NSCLC, respectivamente.

SVV tiene un tropismo conocido por SCLC17,22, y esto se confirma con nuestros datos que muestran actividad antitumoral en múltiples modelos de SCLC. El tropismo tumoral CVA21 está impulsado por la expresión de su receptor de entrada ICAM1, que se expresa en gran medida en NSCLC y otras indicaciones tumorales38,39. Además de su receptor de entrada, el tropismo viral también está limitado después de la entrada por IFN tipo I y factores de restricción virales dentro de la célula infectada. Estos son esenciales para considerar en el contexto de la plataforma de entrega de virus de ARN sintético, ya que utiliza LNP para eludir inicialmente el receptor de entrada viral. Si bien la administración IV del virus de ARN sintético condujo a una amplia distribución tisular, se observó una detección mínima y transitoria de la replicación de SVV o CVA21 en tejidos normales de cepas de ratones sensibles. Estos resultados demuestran la replicación y eliminación selectiva del tumor por la respuesta antiviral del huésped en tejidos normales. En general, los virus de ARN sintético fueron bien tolerados después de una o varias dosis intravenosas en ratones y primates no humanos, al igual que las formulaciones de ARNm/LNP que codifican las proteínas terapéuticas descritas por otros en estudios preclínicos40 y clínicos41.

El modo de acción de los OV implica la destrucción directa de las células cancerosas y la estimulación de la inmunidad antitumoral42. El tratamiento de SCLC y NSCLC podría beneficiarse particularmente de la administración IV repetida de OV como lo permite la plataforma de virus de ARN sintético, ya que las inyecciones intralesionales seguras son un desafío en el cáncer de pulmón. SCLC y NSCLC son conocidos por una alta carga tumoral mutacional43,44, por su sensibilidad a los inhibidores de puntos de control inmunitarios y por ser capaces de replicar SVV y CVA21, respectivamente. Si bien la potente actividad antitumoral del virus de ARN sintético en modelos de tumores humanos xenoinjertados en ratones inmunocomprometidos probablemente se deba a la propagación desenfrenada de la infección dentro del tumor y la oncolisis, es probable que la infección esté limitada por las células inmunitarias que reconocen y eliminan las células infectadas en un huésped inmunocompetente. La detección inmunitaria de la replicación viral puede, a su vez, facilitar la eficacia de los virus de ARN sintético al mejorar el reclutamiento y la activación de las células inmunitarias. Como se observó para otros OVs37, Synthetic-SVV remodeló el TME y aumentó el número de células T CD8 y macrófagos fagocíticos M1. La regulación al alza de PD-L1 en células tumorales y mieloides proporcionó la justificación para combinar Synthetic-SVV con anti-PD-1, demostrando un beneficio terapéutico mejorado por encima de cada monoterapia. El beneficio de los antagonistas de PD-(L)1 actualmente aprobados para el tratamiento de SCLC y NSCLC se limita a un pequeño porcentaje de pacientes; nuestros datos sugieren que combinarlos con virus de ARN sintético puede mejorar los resultados en estos pacientes.

Los virus de ARN sintéticos representan una modalidad terapéutica para el tratamiento del cáncer con el potencial de transformar el paradigma actual de inyección intralesional para VO en una conveniente administración IV repetida. Esta modalidad tiene el potencial de exponer todas las lesiones tumorales dentro de un paciente a un fármaco vivo potentemente oncolítico que puede infectar y propagarse en los tumores mientras estimula las respuestas inmunitarias antitumorales. Synthetic-SVV y Synthetic-CVA21 tienen una potente actividad en modelos preclínicos, incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes, y son bien tolerados en roedores y primates no humanos. Estos datos respaldan la progresión de Synthetic-SVV y -CVA21 a ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón y otras indicaciones tumorales permisivas como monoterapia o en combinación con un régimen de atención estándar que contiene ICI.

Todos los procedimientos experimentales en modelos animales, incluidos ratones y primates no humanos, fueron revisados ​​y aprobados por los respectivos Comités institucionales de cuidado y uso de animales, y siguieron las pautas de los NIH, tal como se especifica en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8.ª edición. Los estudios de NHP se realizaron en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).

Las RT-qPCR se recolectaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro de ThermoFisher (Applied Biosystems). Las secciones de inmunohistoquímica (IHC) se escanearon digitalmente con Hamamatsu Nanozoomer, el citómetro de imágenes Spectra Max i3X minimax se utilizó para cuantificar la fluorescencia y la caracterización de nanopartículas lipídicas (LNP) se realizó con Zetasizer Nano ZS, BO LSRFortessa con el software BO FACSDiva v8.0.3. Para los ensayos de inmunofluorescencia (IF), las imágenes se adquirieron en el escáner 30 Histec Panoramic 250. Para NanoString, las muestras se analizaron con el analizador digital nCounter. La concentración de lípidos de OC se determinó mediante análisis LC-MS. Para el paso cromatográfico se utilizó un sistema Waters Zevo TQs equipado con un detector MRM.

Se utilizaron Microsoft Excel (Office 365), Graphpad Prism v9, FlowJo vl0.7.1 y 30 Histec Caseviewer 2.4 (CaseViewer-3DHISTECH Ltd.) para analizar los portaobjetos FISH. QuPath se utilizó para evaluar DLL3 IHC. La recolección de datos se llevó a cabo en el analizador digital nCounter (NanoString Technologies).

Líneas celulares NCI-H466 (HTB-171), NCI-H82 (HTB-175), NCI-H1299 (CRL-5803), SK-MEL-28 (HTB-72), CT26 (RL-2638), 4T1 (CRL -2539) y N1E-115 (CRL-2263) se compraron todos de ATCC (Gaithersburg, MD). CT-2A-luc (SCC195) y MCC14/2 (10092303) se adquirieron de Millipore Sigma (Burlington, MA). La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 fue amablemente donada por el Prof. Joseph Glorioso de la Universidad de Pittsburgh. Los cultivos de células NCI-H446, NCI-H82, NCI-H1299, SK-MEL-28, MCC14/2, CT26 y 4T1 se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Gibco, Gaithersburg, MD) complementado con 10 % de FBS (Gibco, Gaithersburg, MD) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco, Gaithersburg, MD). Se cultivaron células MC38, CT-2A-luc y N1E-115 en medio DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado con FBS inactivado por calor al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Todos los cultivos celulares se incubaron en atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37 °C.

Las secuencias de cadena positiva picornaviral se obtuvieron de NCBI (SVV-00145 (GenBank: DQ641257) y CVA2146 (Genbank: AF546702.1). Se diseñaron ribozimas personalizadas para el 5 'de la plantilla viral y secuencias de poliadenosina (pA) de 30 nucleótidos. se agregaron al extremo 3', seguidos por el sitio de restricción SapI (SVV) o BsmBI (CVA21) para generar plantillas de politimidina de la longitud adecuada después de la linealización.La mutación SVV-S177A se introdujo mediante mutagénesis puntual para el virus SVV-S177A utilizado en la figura complementaria 8, y el virus SVV sintético, SVV (S177A-IRES2) está compuesto por SVV-001, incluida esta mutación y un IRES mejorado, SVV IRES2. Esta secuencia se deriva de SVA/Canada/MB/NCFAD-104-1 /2015 (GenBank: KY486156). Las plantillas IVT se construyeron con fragmentos de dsDNA sintéticos (IDT Geneblocks, Genscript, Piscataway, NJ) y ensamblaje Gibson (NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, catálogo n.° E2621L, NEB, Ipswich, MA) siguiendo el protocolo del fabricante Estas construcciones se secuenciaron de extremo a extremo, se linealizaron con SapI (SVV) o BsmBI (CVA21) (NEB SapI # R0569L, BsmBI # R0739L, Ipswich, MA) y IVT de grado de investigación (NEB HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit Catalog #E2040S, Ipswich, MA) para asegurar el arranque viral. Todas las cepas virales utilizadas en este trabajo se obtuvieron con estos sistemas de genética inversa.

Se realizaron IVT a gran escala (20-100 mg) en Aldevron (Fargo, ND) y se purificaron por diafiltración. En algunos casos, las IVT (1–50 ml) se realizaron internamente usando un bloque de calentamiento (Eppendorf Thermomixer, Hamburgo, Alemania) a 37 °C durante 2,5 h usando un tampón que contenía acetato de magnesio, Tris-HCl (EMD-Millipore, Danvers, MA), TCEP (EMD Millipore Danvers, MA), NTP equimolares (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), pirofosfatasa inorgánica (NEB Ipswich, MA) y T7 RNAP (NEB, Ipswich, MA). Se añadió ADNasa I (NEB, Ipswich, MA) al final de la IVT durante 30 min y se inactivó con EDTA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A continuación, se realizó la filtración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de mPES de 100 kDa (Repligen, Marlborough, MA) y se diafiltró usando agua. Posteriormente, el retenido de TFF se ajustó en sal y se cargó en una columna de cromatografía Oligo-dT (BIA Separations, Ajdovščina, Eslovenia). El ARN que contenía una cola pA se eluyó usando agua. Se realizó un paso final de TFF como un paso de desalinización para garantizar que se lograran la concentración de ARN deseada (1,0 mg/mL) y el pH (6,5). Estos ARN fueron la base para la generación de LNP.

Los LNP se prepararon mezclando volúmenes apropiados de lípidos en etanol con una fase acuosa que contenía ARNv utilizando un dispositivo de microfluidos NanoAssemblr (Precision NanoSystems) seguido de un procesamiento posterior. Usando una relación de flujo de fase acuosa: orgánica de 3:1, las soluciones se combinaron usando un chip de microfluidos y una velocidad de flujo total de 12 ml/min. Los LNP se dializaron frente a un tampón de pH neutro como PBS 1x para eliminar el etanol y elevar el pH. Los LNP resultantes se concentraron utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra con un límite de peso molecular de 100.000 Da (Millipore, Burlington, MA). La encapsulación de ARN se analizó utilizando Quant-iT RiboGreen (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) y un lector de microplacas (SpectraMax, San Jose, CA). El tamaño hidrodinámico y el PDI de los LNP se analizaron mediante dispersión de luz dinámica utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, Malvern, Reino Unido).

La producción de stock viral se realizó mediante transfección de ARNv utilizando Lipofectamine RNAiMax® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se añadió reactivo de transfección (1 μg/ml) a células NCI-H1299 sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos a 1 × 105 células/pocillo. Después de 72 h después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 2000 × g durante 5 minutos y se filtraron a través de un filtro de 0,45 μm. Se utilizó sobrenadante filtrado (100 μl) para infectar una nueva placa de 12 pocillos sembrada con células NCI-H1299. Después de 72 h, las células y los sobrenadantes se sometieron a 3 ciclos de congelación y descongelación, luego se centrifugaron y filtraron. A continuación, se usó el sobrenadante (1 ml) para infectar células NCI-H1299 cultivadas hasta un 80 % de confluencia en un recipiente de cultivo de tejidos CellSTACK® (Corning, Corning, NY) de dos cámaras en 250 ml de medio de crecimiento. Después de 96 h después de la infección, las células y los sobrenadantes se congelaron y descongelaron 3 veces, se centrifugaron, filtraron y concentraron utilizando unidades de filtro centrífugo 100K Amicon® Ultra 15 (Millipore, Burlington, MA) hasta un volumen final de 10 ml que se alicuotó y almacenado a -80 °C.

Para cuantificar la infectividad de SVV por IC50, se sembraron células NCI-H446 en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 1 × 104 células/pocillo y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %. Después de 48 h, se aspiró el medio de cultivo y se reemplazó con diluciones en serie de 10 veces de SVV infeccioso en un volumen de 100 µL. Después de 48 h, la viabilidad celular de las células infectadas o tratadas de forma simulada se midió con el ensayo luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices, citómetro de imágenes SpectraMax i3X minimax, San Jose, CA). Los datos sin procesar se convirtieron en porcentaje de supervivencia en relación con la infección simulada. Los valores se graficaron en GraphPad Software Prism 9.0 y se analizaron usando un gráfico sigmoidal no lineal con pendiente variable (regresión lineal asimétrica de cuatro puntos) para generar valores de IC50. Se analizaron al menos cinco repeticiones técnicas para cada muestra para calcular IC50.

Para cuantificar el título de SVV por ensayo de placas, se sembraron 2 × 105 células MCC14/2/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Después de 24 h, el virus infeccioso se diluyó en serie 10 veces en medios sin suero. Se aspiró el medio de cultivo de las células y se reemplazó con 300 µl/pocillo de virus diluido durante un período de adsorción de 1 h a 37 °C con balanceo suave. Las muestras de virus se analizaron técnicamente por triplicado. Tras la adsorción, se añadieron a cada pocillo 2 ml de metilcelulosa al 1 % precalentada en medio con FBS al 5 %. Después de 48 h, los pocillos se aspiraron y se tiñeron con una solución de cristal violeta. Las colonias formadoras de placas discretas se contaron manualmente para determinar el título.

Para cuantificar el virus CVA21 mediante ensayo de placa, se sembraron 2 × 105 células SK-MEL28/pocillo en una placa de 24 pocillos (o 2,5 × 105 células NCI-H1299/pocillo en una placa de 12 pocillos). Se produjeron homogeneizados de tejido de ratón resuspendiendo muestras de tejido congelado pulverizado en 2 µl de PBS/mg de tumor. Después de mezclar, las muestras se sedimentaron y se recuperaron los sobrenadantes. Los homogeneizados de tejido completo se diluyeron en serie 10 veces en medios sin suero. Después de retirar el medio, se añadieron 250 μl de las diluciones a cada pocillo. La placa se agitó suavemente a 37 °C durante 1 h. Luego, se añadió 1 ml de metilcelulosa al 1 % precalentada en medio que contenía FBS al 5 % como recubrimiento. Las placas se incubaron durante 48 h antes de agregar 250 μl de colorante violeta cristal a cada pocillo; luego, se retiró la capa protectora y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavaron y se dejaron secar para visualizar las placas.

Se generaron antisueros de SVV de conejo policlonal contra SVV inactivado con UV en Maine Biotechnology Services (Portland, ME). Para medir el título de neutralización, se sembraron células NCI-H446 en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a razón de 1 × 104 células/pocillo en medio completo y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %. Después de 48 h, se mezcló 1 × 107 TCID50/mL de SVV con suero anti-SVV de conejo diluido en medio completo. Se analizaron diluciones seriadas dobles de sueros de 1:20 a 1:5120. Se aspiró el medio de cultivo de las células y se reemplazó con 100 µl de SVV diluido por pocillo. Las células se volvieron a incubar a 37 °C, 5 % de CO2 y se realizaron ensayos de viabilidad in vitro a las 48 h después de la infección mediante la adición de 100 µl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, Madison, WI). La luminiscencia total (RLU) se midió en un lector de placas (Molecular Devices, citómetro de imágenes SpectraMax i3X minimax, San Jose, CA). Los datos sin procesar se convirtieron en porcentaje de supervivencia en relación con la infección simulada, y los valores se graficaron en GraphPad Software Prism 9.0.

Las células NCI-H82 se recolectaron separándolas con tripsina-EDTA (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts), se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 5 %. Se incubaron un millón de células por ml con 10 µg/ml de anticuerpo conjugado con ficoeritrina específico de DLL3 (n.° de cat. 154003) o control de isotipo (n.° de cat. 400607). Ambos anticuerpos se adquirieron de BioLegend (San Diego, EE. UU.) y los datos se adquirieron en un BD LSRFortessa con el software BD FACSDiva y se analizaron con el software FlowJo.

Se realizaron experimentos in vivo en modelos tumorales de xenoinjerto NCI-H466, NCI-H82, NCI-H1299 y SK-MEL-28 en ratones hembra desnudos NU/NU de 8 a 12 semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) . El modelo de tumor de neuroblastoma murino N1E-115 se estableció en ratones hembra A/J de 8 a 12 semanas de edad (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Para los estudios en modelos tumorales 4T1 y CT26, se utilizaron ratones hembra BALB/c de 8 a 12 semanas de edad (Charles River Laboratories). Los estudios que utilizaron el modelo tumoral MC38 y CT-2A-luc se realizaron en ratones hembra C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad (Charles River Laboratories). Según las normas de la IACUC, los ratones con tumores subcutáneos se sacrificaron de forma humanitaria una vez que el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3. En algunos casos, este límite se superó el último día de medición y los ratones se sacrificaron inmediatamente. Con excepción de estos casos, no se produjeron desviaciones del protocolo aprobado y no se superó el volumen tumoral máximo. Todos los animales tenían acceso ilimitado a una dieta de roedores estéril, peletizada y agua purificada por ósmosis inversa y se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h con acceso a enriquecimiento ambiental. Todos los protocolos de animales para ratones y primates no humanos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Oncorus (IACUC) y se realizaron de acuerdo con las regulaciones de IACUC.

Para establecer modelos de tumor de xenoinjerto subcutáneo, se inyectaron 5 × 106–1 × 107 células tumorales viables en el flanco derecho de ratones desnudos en 100 µl de una mezcla de Matrigel (Corning, Glendale, AZ):PBS (Gibco, Gaithersburg) (1:1 v/v). Para el modelo de tumor N1E-115 singénico subcutáneo, se inyectaron 5 × 105 células N1E-115 viables en 100 µl de Matrigel en una mezcla de PBS (1:1 v/v) en el flanco derecho de ratones A/J. El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron el volumen predeterminado de 150 ± 30 mm3 para modelos de xenoinjerto humano y 100 ± 25 mm3 para modelo de tumor singénico. Los animales se emparejaron por pares en función del volumen del tumor y se asignaron aleatoriamente a los brazos de tratamiento. Los virus de ARN sintético se dosificaron por vía intravenosa en dosis que oscilaron entre 0,025 y 3,0 mg/kg a intervalos semanales para un número total de hasta 4 dosis, como se explica en las leyendas de las figuras.

El anticuerpo anti-PD-1 de ratón (clon RMP1-14, n.° de cat. BE-0146, BioXCell, Lebanon, NH) o el control de isotipo IgG2a de rata (clon 2A3, n.° de cat. BE0089, BioXCell, Lebanon, NH) se administraron por vía intraperitoneal ( IP) a una dosis de 200 µg/ratón, administrados 3 veces cada 3 días.

Para el modelo de tumor SCLC ortotópico, se implantaron 5 × 106 células NCI-H82 viables suspendidas en una mezcla de Matrigel:PBS (1:1 v/v) en el lóbulo pulmonar izquierdo mediante inyección intratorácica. El tratamiento comenzó 2 semanas después de la inoculación de células ortotópicas y consistió en 2 dosis IV de 1,0 mg/kg de Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV administradas con 7 días de diferencia. Para el análisis de supervivencia, se observaron ratones para criterios de valoración de supervivencia predeterminados, que en el caso de tumores pulmonares ortotópicos comprendían síntomas de enfermedad pulmonar y condiciones corporales disminuidas (es decir, pérdida de peso corporal superior al 20%).

Para el modelo de tumor MC38 subcutáneo, se inyectaron 5 × 105 células MC38 viables en 100 µl de PBS en el flanco derecho de ratones C57BL/6. Se establecieron modelos de cáncer de mama murino (4T1) y carcinoma de colon (CT26) en ratones BALB/c mediante inyección subcutánea de 1 × 106 células en 100 µl de PBS en el flanco derecho de los animales. Cuando los tumores alcanzaron los 250 mm3, los ratones se sacrificaron sin crueldad, los tumores se recolectaron, se disociaron enzimáticamente y se inmunofenotiparon, como se describe a continuación. Para los tumores ortotópicos de glioma de ratón CT-2A-luc, se establecieron en ratones hembra C57BL/6 de 11 a 12 semanas de edad mediante inyección intracerebral de 5 × 104 células CT-2A-luc suspendidas en 2 µl de PBS. Se permitió que los tumores crecieran durante 14 días; luego, los ratones fueron sacrificados humanamente, los tumores fueron recolectados, disociados enzimáticamente e inmunofenotipados, como se describe a continuación.

Se inmunizaron pasivamente ratones desnudos con tumores NCI-H446 subcutáneos contra SVV mediante inyección intraperitoneal de 1,5 mg de antisuero de SVV de conejo. Los animales de control recibieron una cantidad correspondiente de suero de conejo normal (Suero de conejo normal, ImmunoReagents, Inc., Raleigh, NC). El ciclo de inmunización se repitió dos veces con 7 días de diferencia. Después de 24 h después de cada transferencia de suero adoptiva, los ratones de control e inmunizados pasivamente se trataron por vía intravenosa con 106 UFP de viriones de SVV o 0,1 mg/kg de SVV sintético. Según las normas de la IACUC, los ratones se sacrificaron de forma humanitaria una vez que el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3. En algunos casos, este límite se superó el último día de medición y los ratones se sacrificaron inmediatamente. Exceptuando estos casos, no se produjeron desviaciones del protocolo aprobado y no se superó el volumen tumoral máximo.

Para establecer el modelo SCLC PDX, se implantaron fragmentos de 2 × 2 mm de tumores SCLC LU5184 (Crown Bioscience, San Diego) utilizando un trocar estéril en ratones hembra NOD SCID de 6 a 8 semanas de edad (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME ). El tratamiento comenzó una vez que los tumores alcanzaron un volumen predeterminado de aproximadamente 150 mm3 ± 50 mm3. Los animales se emparejaron por pares en función del volumen del tumor y se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Synthetic-SVV y Synthetic-SVV-Neg se dosificaron en 2 dosis intravenosas de 1,0 mg/kg administradas semanalmente. Los animales en tratamiento se observaron diariamente para detectar manifestaciones clínicas de eventos adversos, el peso corporal y los volúmenes tumorales se registraron cada dos semanas. Según lo aprobado por IACUC de Crown Bioscience, los ratones fueron sacrificados de forma humanitaria una vez que la carga tumoral alcanzó los 3000 mm3. No se produjeron desviaciones del protocolo aprobado y no se superó el volumen tumoral máximo.

Para el análisis farmacodinámico de la replicación del virus en tumores SCLC PDX, los ratones portadores de tumores se trataron con una dosis intravenosa única de 1 mg/kg de Synthetic-SVV o Synthetic-SVV-Neg. Cinco días después del tratamiento, los tumores se recolectaron y procesaron para evaluar el ARN de SVV de cadena negativa mediante RT-qPCR. Otro grupo de ratones se trató con 2 dosis intratumorales de 106 UFP de viriones de SVV en los días 1 y 3. Dos días después del segundo tratamiento, los tumores se recolectaron y procesaron para evaluar el ARN de SVV de cadena negativa mediante RT-qPCR.

El modelo SCLC GEMM se estableció como se describió anteriormente33 en el Núcleo de pruebas, imágenes y modelos preclínicos (PMIT) del Instituto Koch. Brevemente, ratones RPM de 8 semanas de edad (ratones Rb1fl/fl Trp53 fl/fl fl/fl Myc LSL/LSL (RPM) que contenían un alelo MycT58A regulable por recombinasa Cre bajo el control de un promotor CAG, The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME) fueron anestesiados e infectados con 106–108 PFU de virus Ad5-Cgrp-Cre (Universidad de Iowa) mediante instilación intratraqueal como se describe en otra parte47. De acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad, los virus se administraron en una sala de Bioseguridad Nivel 2+. Los ratones machos y hembras se dividieron por igual entre los grupos de tratamiento para todos los experimentos. MicroCT controló el desarrollo de tumores ortotópicos SCLC. Se recolectaron los tumores y se estableció y mantuvo un cultivo primario en medio DME (Gibco, Gaithersburg, MD) complementado con FBS inactivado por calor al 10 % (Gibco, Gaithersburg, MD) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco, Gaithersburg, MD) . Para establecer modelos de tumores subcutáneos, se inyectaron 5 × 106 células tumorales primarias viables en el flanco derecho de ratones desnudos en 100 µl de Matrigel (Corning, Glendale, AZ): mezcla de DME (Gibco, Gaithersburg) (1:1 v/v) en el flanco derecho de los ratones RPM. El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron el volumen predeterminado de 100 ± 30 mm3. Synthetic-SVV y Synthetic-SVV-Neg se dosificaron en 2 dosis intravenosas de 1,0 mg/kg administradas semanalmente. Los animales en tratamiento se observaron diariamente para detectar manifestaciones clínicas de eventos adversos, el peso corporal y los volúmenes tumorales se registraron cada dos semanas. De acuerdo con las regulaciones de IACUC, los ratones fueron sacrificados humanamente una vez que la carga tumoral alcanzó los 2000 mm3. No se produjeron desviaciones del protocolo aprobado y no se superó el volumen tumoral máximo.

Para el análisis farmacodinámico de la replicación del virus en tumores SCLC GEMM, los ratones portadores de tumores se trataron con 2 dosis IV de 1 mg/kg de Synthetic-SVV o PBS. Cinco días después del tratamiento, los tumores se recolectaron y procesaron para evaluar el ARN de SVV de cadenas negativas y positivas mediante RT-qPCR y perfiles transcripcionales utilizando NanoString Mouse PanCancer IO 360 Gene Expression Panel (Datos complementarios 1, los datos sin procesar en un panel por animal/muestra base y se incluyen las puntuaciones de IO360).

La tolerabilidad se evaluó en ratones A/J permisivos a SVV que portaban tumores N1E-115 subcutáneos establecidos como se describe anteriormente en el presente documento. Los animales recibieron dosis IV de 3 mg/kg de Synthetic-SVV y se observaron diariamente para detectar síntomas clínicos. Se recogieron los pesos corporales al menos durante 3 días consecutivos después de cada tratamiento. Las respuestas inmunes se analizaron a las 6 y 24 h después del tratamiento IV, mientras que la patología clínica se evaluó al final del estudio. Para el análisis de biodistribución, los tejidos (bazo, hígado, corazón, pulmón, riñón, músculo, tumor) se recogieron después de 30 min, 24 h y 7 días y se analizaron mediante LC-MS. La replicación viral se evaluó en ratones A/J vírgenes después de un único tratamiento IV con 3 mg/kg de Synthetic-SVV. Los tejidos (bazo, hígado, corazón, pulmón, riñón) se recogieron después de 24 horas y 7 días y se analizaron por ensayo de título de placa.

La tolerabilidad se evaluó en ratones transgénicos huICAM1 permisivos a CVA21 después de una dosis IV de 1,6 mg/kg de Synthetic-CVA21. Los animales se observaron diariamente en busca de síntomas clínicos de eventos adversos y se pesaron durante 5 días consecutivos después del tratamiento. La patología tisular y la replicación de CVA21 en los animales tratados se evaluaron 2 y 7 días después del tratamiento.

Está bien establecido en la literatura que la farmacocinética de tolerabilidad, la respuesta inmune, la biodistribución y la tolerabilidad difieren mucho entre ratones y NHP con respecto a las nanopartículas lipídicas48. La tolerabilidad en NHP se evaluó utilizando monos cynomolgus machos de 3 a 7 años de edad originarios de Mauricio (Envigo, Indianápolis, IN). Los animales se alojaron en un ambiente con temperatura y humedad controladas (18–30 °C y 30–70 %, respectivamente). Se mantuvo el ciclo de luz/oscuridad de 12 h controlado automáticamente, excepto en los momentos en que se realizaron los procedimientos programados. Todos los animales tuvieron acceso ilimitado al agua, fueron alimentados con la dieta de laboratorio NHP 250 y tuvieron acceso al enriquecimiento ambiental como se describe en los procedimientos operativos estándar.

Se administró SVV sintético a una dosis de 1 mg/kg en infusión IV de 60 min a través de una vena periférica (cefálica o safena) en animales no sedados con restricción temporal. El tratamiento se repitió a intervalos quincenales para un número total de 3 dosis. El primer día de dosificación se designó como el día 1. Para el análisis farmacocinético, se recolectaron muestras de sangre al final de la infusión (EOI), 5 min, 0,5, 2, 8, 12, 24 y 48 h. La concentración plasmática de lípidos ionizables (OC) se determinó mediante LC-MS. La evaluación farmacocinética no compartimental se realizó utilizando el software Phoenix WinNonlin versión 8.3 (Certara, Princeton, NJ). Para el análisis de patología clínica, se recolectaron muestras de sangre antes de la dosis, así como 2, 6 y 24 h después de cada tratamiento. Se evaluaron los niveles plasmáticos de hematología, química clínica, citoquinas y componente C5b9 del complemento. Se recogieron muestras de tejido (cerebro, mesencéfalo, cerebelo, bulbo raquídeo, médula espinal, corazón, hígado, riñón, pulmón, bazo, ganglio linfático mesentérico, músculo esquelético) para el análisis de biodistribución 24 h después del tercer tratamiento IV, se congelaron rápidamente y se evaluó la presencia de ARN de SVV de cadena positiva mediante análisis RT-qPCR.

La química clínica se analizó utilizando el analizador Randox Imola (Randox, Kearneysville, WV) o el análisis hematológico realizado en el analizador automatizado Siemens Advia 120 (Siemens Healthcare GmgH, Erlangen, Alemania).

El análisis de los niveles plasmáticos de citocinas proinflamatorias se realizó mediante NHP y ensayo multiplex específico de ratón (K15056D y K15048D, respectivamente; Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Además, se analizaron MCP-1 y TNFα de mono cynomolgus usando kits de ensayo de analito único (K156UCK, K156NND, respectivamente; Meso Scale Diagnostics). De manera similar, la MCP-1 de ratón se analizó utilizando un kit de ensayo de un solo complejo (K152NN, Meso Scale Diagnostics).

Los niveles del componente del complemento C3 de ratón se analizaron usando el kit ELISA de complemento C3 de ratón (ab157711, Abcam, Waltham, MA). Los niveles de C5b9 en plasma de mono cynomolgus se analizaron utilizando el kit ELISA C5b9 humano (558315, BD, Franklin Lakes, NJ).

Las muestras se mantuvieron congeladas durante todo el procedimiento anterior a la extracción de ARN usando hielo seco y nitrógeno líquido para congelar rápidamente. Las muestras se pulverizaron utilizando el pulverizador seco automatizado Cp02 cryoPREP (Covaris, 500001, Covaris, Woburn, MA) para muestras de tumores tratados con SVV y CVA21. Para las muestras de SVV, se pesaron 10 mg de muestra pulverizada y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 2 ml (Sample Tube RB, QIAGEN 990381, Hilden, Alemania). Se añadió tampón RLT Plus con B-mercaptoetanol (600 µl) a cada muestra y se lisaron. Los pasos restantes se realizaron con QIAcube (QIAGEN, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante para el mini kit QIAGEN RNeasy Plus (QIAGEN 74134) en la sección de Purificación de ARN total de tejidos animales. Las muestras de ARN se trataron con ADNseI (sin ARNasa) (New England Biolabs, #M0303S, Ipswich, MA) después de la extracción.

Para las muestras de CVA21, se pesaron 10 mg de muestra pulverizada y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadió a cada muestra una mezcla de tampón de lisis/proteinasa K (400 µl) (kit de tejido RNAdvance, Beckman Coulter, A32649, Pasadena, CA). Las muestras se incubaron a 37 °C durante al menos 30 min para lisarlas por completo. Los pasos restantes se realizaron con Biomek i5 (Beckman Coulter, B87583, Pasadena, CA) siguiendo el protocolo del fabricante (Kit de tejido RNAdvance). El kit de tejido RNAdvance incluye un paso de tratamiento con ADNasa I.

Las muestras de ARN se normalizaron a una entrada igual para la síntesis de ADNc. Se usaron cebadores específicos de cadena negativa de virus para sintetizar ADNc. El cebador específico de cadena negativa de SVV 5′-GCGCAAATTCGTCCAAAACAACGAC-3′, el cebador específico de cadena positiva de SVV 5′ ACATAGAAACAGATTGCAGCTTCTC -3′ y el cebador específico de cadena negativa de CVA21 5′-AGACTACGGACTGACCATGACTC TTAGGACGCTTTTACTGAGAAC -3′ fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa). Tanto para SVV como para CVA21, la síntesis de ADNc se realizó utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript IV (Invitrogen, 18091200, Carlsbad, CA) y sus cebadores específicos respectivos.

El análisis de PCR cuantitativa (qPCR) se realizó utilizando la química de la sonda TaqMan. Se realizaron reacciones de qPCR (20 µL) que contenían 10 µL de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, 4444557, Foster City, CA), 1 µL de TaqMan Gene Expression Assay, sonda FAM (Applied Biosystems, 4332078), 4 µL de nucleasa -agua libre y 5 µL de cDNA diluido. Las sondas del ensayo de expresión génica TaqMan se personalizaron para SVV o CVA21. Sonda SVV 5′-TGGAAGCCATGCTCTCCTACTTCA-3′, cebador directo 5′-CGACGGCTTATACAAACCAGTTA-3′, cebador inverso 5′-AGCTTCTCGAGTAGTGTTCCT-3′ y sonda CVA21 5′-TGCCTATGGTGATGACGTGATAGCT-3′, cebador directo 5′- GAGAACCTACAAGGGCATAGAC-3′, y el cebador inverso 5'-TAGGAGACTAGCGTCAACCT-3' se solicitaron de forma personalizada a través de Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Parámetros qPCR 95 °C durante 20 s seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 1 s y 60 °C durante 30 s. Cada ensayo de qPCR contenía triplicados técnicos para cada estándar y muestra.

Los tumores se recolectaron en los puntos de tiempo indicados, se dividieron en dos, se fijaron en formalina tamponada al 10 % durante 24 h a temperatura ambiente y se incluyeron en parafina. RNAscope FISH de cadenas de ARN negativas y positivas de SVV se realizó en Advanced Cell Diagnostics (ACD, Newark, CA). Se utilizaron condiciones de pretratamiento fluorescente estándar RNAscope LS Multiplex. Brevemente, la recuperación del epítopo se realizó a los 15 min a 95 °C, seguida de un tratamiento con proteasa III durante 15 min a 40 °C. Primero se evaluó la calidad de las muestras utilizando los controles de referencia positivo y negativo para la especificidad y la sensibilidad (n.º de catálogo de ACD 313908 y 320758, respectivamente). Se diseñaron sondas SVV personalizadas para las cadenas positiva y negativa (n.º de catálogo de ACD 819848 y 819858-C2, respectivamente) y se confirmó que eran específicas. Todas las muestras pasaron el control de calidad con tinción de control positivo y se observó poca o ninguna tinción de fondo. Los datos RAW se analizaron con 3DHISTECH CaseViewer Software (3DHISTECH Ltd, Budapest, Hungría).

La concentración de lípidos de OC se determinó mediante análisis LC-MS. Se preparó una solución madre estándar a 100 ng/ml en ácido fórmico al 1% en metanol. Para el análisis de muestras de plasma, se diluyó el stock estándar en plasma a 200, 180, 120, 40, 20, 5, 1 y 0,5 μg/ml, mientras que para el análisis de tejidos se generó una curva estándar a 80, 72, 48, 16, 8, 2, 0,4 y 0,2 mg/ml en homogeneizado de tejido. Se mezclaron cinco µl de muestra de plasma con 120 µl de control estándar interno (IS-C), se agitaron con vórtex durante 3 min y se centrifugaron a 12 500 RPM a 5 °C durante 4 min. Se mezclaron sesenta µl del sobrenadante resultante con 140 µl de solución de agua:acetonitrilo (3:7 v/v) y se agitó durante 5 min. Se inyectó una alícuota de 0,6 µl del sobrenadante resultante para el análisis LC-MS.

Veinticinco µl de homogeneizados de tejido obtenidos a partir de muestras de tejido homogeneizadas en agua en una proporción de 1:1 mμm se mezclaron con IS-C, se agitaron durante 3 min y luego se mezclaron con 140 µl de agua y una solución de acetonitrilo (3:7 v/v) y se agita durante 5 min. Se inyectó una alícuota de 0,6 µl del sobrenadante resultante para el análisis LC-MS.

Para la separación cromatográfica se utilizó un sistema Waters Zevo TQs equipado con un detector MRM. La separación se llevó a cabo en una columna XB-C8 (50 mm × 2,1 mm, 3,6 μm) con un volumen de inyección de 0,6 μl. Las fases móviles consistieron en ácido fórmico al 0,1 % en agua (A) y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo: alcohol isopropílico (66:34 v/v) (B). Las muestras se analizaron utilizando un caudal de 0,5 ml/min y el siguiente programa de gradiente: 54–100 % B (0–1,51 min), 100 % B (1,51–1,8 min), 100–54 % B (1,80–1,81 min ), y 54% B (1,81–2,8 min). La ionización se logró utilizando ionización por electropulverización (ESI) en modo positivo con detección MRM.

Los pulmones se recolectaron de los animales tratados 10 días después de la segunda dosis de SVV sintético y se fijaron en formalina tamponada al 10 % durante 24 h, se procesaron con parafina y se seccionaron al nivel de los bronquios principales. Para la detección IHC de DLL3, las secciones se tiñeron con anticuerpo de conejo específico para DLL3 humano (0,5 μg/ml, Clone E3J5R, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), se escanearon digitalmente y se sometieron a análisis morfométrico utilizando el software QuPath.

Los tumores ultracongelados (n = 5 ratones por grupo de tratamiento) se pulverizaron y el ARN se extrajo con QIAcube (QIAGEN, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante para el kit QIAGEN RNeasy Plus Mini (QIAGEN 74134) en la sección de Purificación de ARN total de tejidos animales. El ARN aislado total (60 ng) se mezcló en un volumen final de 25 µl con una sonda de captura biotinilada en 3' y sondas indicadoras en 5' del panel de expresión génica Mouse PanCancer IO 360. La hibridación se realizó a 65 °C durante 16 h. Las muestras hibridadas se aislaron en la estación de preparación NanoString nCounter donde se eliminó el exceso de sonda y los complejos hibridados de sondas y secuencias de ARN diana se inmovilizaron en el cartucho. A continuación, las muestras unidas al cartucho se analizaron con el analizador digital nCounter. La recopilación de datos se llevó a cabo en el analizador digital nCounter (NanoString Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante para contar los códigos de barras fluorescentes individuales y cuantificar las moléculas de ARN diana presentes en cada muestra. Para cada ensayo, se realizó una exploración de alta densidad (600 campos de visión). El número relativo de copias de ARNm relativo del análisis de la expresión génica de Nanostring nCounter™ en 770 genes relacionados con el sistema inmunitario y el cáncer se cuantificó en el sistema NanoString nCounter™ (NanoString Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron utilizando el software de análisis nSolver 4.0 (NanoString). Tras la sustracción de fondo (eliminación de la media geométrica de los controles negativos), cada muestra se normalizó primero a la media geométrica de los controles positivos y luego a la media geométrica de los genes de referencia.

Para la citometría de flujo, los tumores se recogieron el día 14 después de la primera dosis. Los tumores se pesaron y luego se cortaron en pedazos pequeños antes de desagregarse en suspensiones unicelulares utilizando un octodisociador Miltenyi GentleMACs con calentadores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron células AT/NK y un panel de flujo de células mieloides utilizando los siguientes reactivos y clones Ab: Se utilizó un kit de tinción de células muertas rojas fijables LIVE/DEAD™ para excitación a 488 nm (Invitrogen, n.° de catálogo L32102) para evaluar la viabilidad. La tinción de células superficiales se realizó utilizando BD Stain Buffer (Becton-Dickinson Catálogo # 554656) con los anticuerpos para ratón CD45 (30-F11, Catálogo # 103154), CD3ε (17A2, Catálogo # 100218), CD8a (53-6.7, Catálogo n.° 100730), CD4 (RM4-5, n.° de catálogo 100552), CD25 (PC61, n.° de catálogo 102041) CD69 (REA937, n.° de catálogo 130-115-461), CTLA-4 (UC10-4B9, n.° de catálogo 106323), NKP46 (29A1.4, n.° de catálogo 137612), KLRG1 (2F1, n.° de catálogo 138409), CD127 (A7R34, n.° de catálogo 135035), PD-1 (29F.1A12, n.° de catálogo 135216), MHCII (M5/114.15.2, catálogo n.° 107635), Ly6C (H,1.4, n.° de catálogo 128037), CD206 (C068C2, n.° de catálogo 141720), CD86 (GL-1, n.° de catálogo 105037) y PD-L1 (10F.9G2, n.° de catálogo 124312). Foxp3/Factor de transcripción conjunto de tampones de tinción (n.º de catálogo de eBioscience 00-5523-00) se utilizó para la tinción intracelular de FOXP3 (150D, n.º de catálogo 320008) y CTLA-4 (UC10-4B9, n.º de catálogo 106323). Todos los anticuerpos se adquirieron de BioLegend (San Diego, EE. UU.), excepto CD69 Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania). Las diluciones de anticuerpos fueron las siguientes: CD45-APC-Fire750 (1:400), CD3-PerCP-Cy5.5 (1:100), NKp46-BV421 (1:200), CD4-BV785 (1:800), CD8- AF700 (1:400), CD25-BV711 (1:200), Foxp3-PE (1:200), CTLA4-BV605 (1:200), PD1-PE-Cy7 (1:200), CD127-BV510 (1 :100), KLRG1-FITC (1:400), CD11b-BV650 (1:400), MHCII-BV510 (1:200), Ly6C-BV711 (1:200), CD206, PE-Cy7 (1:100) , CD86-BV605 (1:100) y PDL1-APC (1:100). Los datos se adquirieron en un BD LSRFortessa usando el software BD FACSDiva y se analizaron usando el software FlowJo. Para el panel de células T y NK, las células se seleccionaron primero por tiempo (SSC-A frente a tiempo), linfocitos (SSC-A frente a FSC-A) y singletes (FSC-H frente a FSC-A). La puerta de linfocitos se analizó adicionalmente en cuanto a su captación de la tinción Vivo/Muerto para determinar las células vivas frente a las muertas y la expresión de CD45. Luego, las células se seleccionaron en CD3 frente a NKP46 para seleccionar células T o células NK. Para las células T, la población se seleccionó para CD4 frente a CD8, y las células T CD4 se seleccionaron adicionalmente para CD25+ y FOXP3+ para analizar la población de Treg. Las células NK se seleccionaron para NKP46+ y CD3-. Para el panel mieloide, las células se seleccionaron primero por tiempo (SSC-A frente a tiempo), luego linfocitos (SSC-A frente a FSC-A) y singletes (FSC-H frente a FSCA). La puerta de linfocitos se analizó adicionalmente en cuanto a su captación de la tinción Vivo/Muerto para determinar las células vivas frente a las muertas y la expresión de CD45. Luego, los macrófagos se controlaron utilizando SSC-A frente a CD11b+ y, posteriormente, en el subconjunto MHCII+Ly6C. Para distinguir entre macrófagos M1 y M2, usamos CD206-CD86+ para M1 y CD206+CD86- para M2. La enumeración de células por mg de tumor se calculó usando 123Count eBeads (Invitrogen, Catálogo # 01-1234-42, Carlsbad, CA). Se añadió un volumen fijo de perlas con una concentración conocida a cada pocillo antes del análisis por citometría de flujo. Luego se usó el número de perlas en la fracción cerrada para calcular el número de celdas usando la siguiente ecuación:

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el archivo Artículo, Información complementaria o Datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue patrocinado por Oncorus, Inc. Los autores reconocen y agradecen a Sofie Denies por el análisis estadístico, James B. Rottman (Athenaeum Pathology Consulting) por el análisis morfométrico. Los autores también agradecen a Chastity Bradley, PhD de BioMed Writers, LLC, por su revisión editorial y su ayuda con la presentación del manuscrito.

Oncorus, Inc., Cambridge, MA, EE. UU.

Edward M. Kennedy, Agnieszka Denslow, Jacqueline Hewett, Lingxin Kong, Ana De Almeida, Jeffrey D. Bryant, Jennifer S. Lee, Judy Jacques, Sonia Feau, Melissa Hayes, Elizabeth L. McMichael, Daniel Wambua, Terry Farkaly, Amal A Rahmeh, Lauren Herschelman, Danielle Douglas, Jacob Spinale, Sanmit Adhikari, Jessica Deterling, Matt Scott, Brian B. Haines, Mitchell H. Finer, Ted T Ashburn, Christophe Quéva y Lorena Lerner

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Conceptualización: EMK, MF, CQ y LL Metodología: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DW, TF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD, MS, BBH, CQ y LL Software: EMK, AD, JSL, SF y DW Validación: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD y MS Análisis formal: EMK, AD, JDB, JSL, JJ, SF, BBH, CQ, LL Redacción: revisión y edición: EMK, AD, ADA, JDB, JSL, SF, JD, MS, BBH, CQ y LL Supervisión: EMK, AD, SF, BBH, CQ y LL Administración del proyecto: EMK, CQ y LL Aprobación del borrador final: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LF, DD, JS, SA, JD, MS, BBH, TTA, MF, CQ y LL

Correspondencia a Edward M. Kennedy.

EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB y JSL (en el momento en que se realizó el estudio), JJ, SF (en el momento en que se realizó el estudio), MH, ELM, DW, TF, AAR (en el momento se realizó el estudio), LH (en el momento en que se realizó el estudio), DD (en el momento en que se realizó el estudio), JS (en el momento en que se realizó el estudio), SA (en el momento en que se realizó el estudio), JD, MS (en el momento en que se realizó el estudio), BBH (en el momento en que se realizó el estudio), MF (en el momento en que se realizó el estudio), TTA, CQ, LL (en el momento en que se realizó el estudio) son todos los empleados de Oncorus, Inc. Ningún otro autor tiene intereses en competencia para divulgar.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Kennedy, EM, Denslow, A., Hewett, J. et al. Desarrollo de inmunoterapia con virus de ARN sintético administrado por vía intravenosa para el tratamiento del cáncer. Nat Comun 13, 5907 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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Recibido: 11 de marzo de 2022

Aceptado: 24 de septiembre de 2022

Publicado: 07 octubre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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