Desbloqueo de los potenciales de la fotosíntesis de cianobacterias para convertir directamente el dióxido de carbono en glucosa

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3425 (2023) Citar este artículo

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La glucosa es el monosacárido más abundante y sirve como fuente de energía esencial para las células en todos los dominios de la vida y como materia prima importante para la industria de la biorrefinería. La ruta planta-biomasa-azúcar domina el suministro actual de glucosa, mientras que la conversión directa de dióxido de carbono en glucosa a través de la fotosíntesis no está bien estudiada. Aquí, mostramos que el potencial de Synechococcus elongatus PCC 7942 para la producción de glucosa fotosintética puede desbloquearse al prevenir la actividad de la glucoquinasa nativa. La eliminación de dos genes de glucoquinasa provoca la acumulación intracelular de glucosa y promueve la formación de una mutación espontánea en el genoma, lo que eventualmente conduce a la secreción de glucosa. Sin catálisis heteróloga o genes de transporte, la deficiencia de glucocinasa y la mutación genómica espontánea conducen a una secreción de glucosa de 1,5 g/l, que aumenta aún más a 5 g/l mediante ingeniería metabólica y de cultivo. Estos hallazgos subrayan las plasticidades del metabolismo de las cianobacterias y demuestran sus aplicaciones para apoyar la producción fotosintética directa de glucosa.

La glucosa es la molécula de monosacárido más abundante en la naturaleza. La descomposición de la glucosa proporciona energía y materiales de carbono en las células en todos los dominios de la vida, impulsando la maquinaria celular a través de diversas vías glucolíticas, incluida la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la vía de la pentosa fosfato oxidativa (OPP) y la vía de Entner. –Vía de Doudoroff (ED)1,2. Como monómeros, la glucosa y sus derivados también están involucrados en la síntesis de diversas macromoléculas y componentes celulares3,4. Además, la glucosa también sirve como materia prima importante en la industria de la biorrefinería, apoyando el cultivo de múltiples fábricas de células microbianas para la biofabricación ecológica de combustibles, productos químicos y productos farmacéuticos5,6,7. En la naturaleza, la glucosa se sintetiza principalmente a través de la fotosíntesis de plantas y algas y existe como monómeros de polisacáridos en la biomasa de plantas/algas, por ejemplo, celulosa y almidón. La ruta planta-biomasa-azúcar domina el actual suministro masivo de glucosa, cuya factibilidad económica está influenciada por múltiples parámetros, como los ciclos planta-cultivo, el radio de recolección de biomasa y los costos de pretratamiento8,9,10,11.

En el contexto de la crisis climática mundial y el empeoramiento de la escasez de alimentos, sería valioso desarrollar rutas de producción de glucosa más eficientes, continuas e industriales12,13. En los últimos años, la conversión directa de dióxido de carbono en glucosa, precursores de glucosa y polímeros de glucosa se ha logrado por rutas enzimáticas en cascada químico-bioquímica, electroquímica-biológica e in vitro14,15,16. Por el contrario, la producción continua de glucosa no se ha relacionado directamente con la fotosíntesis. En fotoautótrofos, por ejemplo, plantas superiores y algas, la glucosa se sintetiza como almacenamiento de carbono y energía y desempeña importantes funciones reguladoras. El metabolismo de la glucosa posee interacciones complejas con los fotosistemas, perturba la síntesis y el metabolismo de los pigmentos y puede incluso inhibir las actividades fotosintéticas17,18,19; por lo tanto, la glucosa libre rara vez se sintetiza o se acumula en exceso en el metabolismo celular fotosintético. En las cianobacterias, un grupo de microalgas procarióticas oxigénicas, se han realizado algunos avances para facilitar la síntesis y secreción directa de azúcares naturales o no naturales a través de manipulaciones genéticas20,21,22. Sin embargo, la producción fotosintética de glucosa aún no ha sido bien estudiada. Las cepas recombinantes solo pueden producir cantidades limitadas de glucosa acompañadas de la producción de otros azúcares, lo que sugiere que quedan por revelar mecanismos más detallados del metabolismo de la glucosa en los fotoautótrofos23,24.

En este trabajo, nuestro objetivo es diseñar una conversión directa y estable de dióxido de carbono en glucosa a través de la fotosíntesis de cianobacterias. En un modelo de cianobacteria Synechococcus elongatus PCC 7942 (en adelante PCC 7942 para abreviar), identificamos la actividad de la glucoquinasa nativa como el cuello de botella que restringe el metabolismo potencial para la síntesis de glucosa. La eliminación selectiva de dos genes de glucocinasa altera el metabolismo de los carbohidratos y activa un flujo metabólico hacia la glucosa a través de la red metabólica de la sacarosa, que generalmente se considera una respuesta especializada al estrés osmótico. La síntesis mejorada de glucosa promueve el enriquecimiento de una mutación genómica espontánea específica en el cromosoma de PCC 7942, lo que facilita la secreción eficiente de glucosa. Mediante la implementación de múltiples enfoques ómicos combinados con manipulaciones genéticas sistemáticas, aclaramos las vías y mutaciones que conducen a la síntesis y secreción de glucosa y optimizamos el rendimiento de la síntesis de glucosa de las cepas recombinantes. A través de la posterior optimización del cultivo y la ingeniería metabólica, la glucosa secretada por la cepa modificada supera los 5 g/l durante el cultivo a largo plazo, lo que representa hasta el 70 % de la fuente fija de carbono.

Por lo general, hay tres pasos para lograr una producción microbiana eficiente de los metabolitos objetivo: construir vías para la síntesis de los productos25,26, eliminar las reacciones que consumen dichos productos27,28 y facilitar los mecanismos para la secreción del producto20,23. Estudios previos han demostrado que PCC 7942 puede captar glucosa extracelular para la producción de biomasa mediante el uso de transportadores de glucosa heterólogos, lo que demuestra sus capacidades naturales para el consumo de glucosa intracelular29. Dos genes de glucocinasa (Synpcc7942_0221, glk1; Synpcc7942_2111, glk2) que fosforilan la glucosa para iniciar la vía EMP o OPP se han anotado en el genoma de PCC 7942, por lo que se seleccionaron como objetivos knockout para bloquear la reasimilación de glucosa intracelular.

Las manipulaciones se realizaron en paralelo utilizando un PCC 7942 (WT) de tipo salvaje y una cepa recombinante que lleva un transportador de glucosa de origen E. coli GalP (SZ14, figuras complementarias 1 y 2). Previamente, GalP ha demostrado ser efectivo para facilitar la absorción de glucosa en PCC 794229,30, y aquí lo usamos para evaluar los impactos de la deficiencia de glucoquinasa en las capacidades de consumo de glucosa de PCC 7942. Debido a las características de poliploidía de las cianobacterias, los pasajes con antibióticos -la selección era necesaria para aislar los homocigotos deseados. Se obtuvieron fácilmente cepas recombinantes que portaban un gen de glucoquinasa inactivado (glk1 o glk2), pero fue difícil aislar homocigotos con glk1 y glk2 inactivados simultáneamente en WT. Entre varios intentos independientes, solo un proceso dio como resultado una cepa homocigota (SZ3) con un genotipo personalizado (glk1 y glk2 completamente bloqueadas) después de seis semanas de pases continuos, mientras que todos los demás fallaron (lo que significa que la copia de tipo salvaje de glk1 o glk2 no se pudo eliminar). Los resultados indicaron que la glucoquinasa podría tener funciones fisiológicas esenciales y que podrían ser necesarias mutaciones genómicas secundarias potenciales para la aclimatación celular a la deficiencia. En la cepa SZ14 que lleva el transportador GalP, el homocigoto mutante (SZ17) con glk1 y glk2 bloqueadas simultáneamente se aisló más fácilmente, lo que indica que la actividad de GalP podría amortiguar la alteración causada por la deficiencia de glucocinasa.

Los ensayos enzimáticos revelaron que ambos genes (glk1 y glk2) contribuyeron a la actividad de glucoquinasa en PCC 7942, y su desactivación simultánea redujo la actividad de glucoquinasa en aproximadamente un 70 % en SZ3; en cuanto a la cepa SZ14 con transportador GalP, la actividad de la glucoquinasa se redujo aún más significativamente al eliminar los dos genes (en SZ17) a un nivel más bajo que el de SZ3 (Fig. 1a). Las actividades residuales de glucoquinasa podrían atribuirse a otras quinasas no específicas (p. ej., fructoquinasa y fosfofructoquinasa). La mayor actividad de glucoquinasa residual en SZ3 que en SZ17 indicó que el fondo de tipo salvaje parecía esencial para mantener un cierto grado de actividad de glucoquinasa, por lo que la cepa recombinante experimentó una domesticación a largo plazo para adaptarse a la pérdida de actividades por mecanismos inciertos.

a Actividad glucoquinasa relativa de WT, SZ1 (Δglk1), SZ2 (Δglk2), SZ3 (Δglk1-Δglk2), SZ14 (ΔNS3::galP), SZ15 (ΔNS3::galP-Δglk1), SZ16 (ΔNS3::galP-Δglk2 ) y SZ17 (ΔNS3::galP-Δglk1-Δglk2) cultivadas en condiciones autotróficas. b Crecimiento de SZ14, SZ15, SZ16 y SZ17 en medio de cultivo BG11 con o sin glucosa suplementada. c Actividad de glucocinasa de SZ14, SZ15, SZ16 y SZ17 cultivadas en condiciones mixotróficas complementadas con glucosa 30 mM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas (*p < 0,05, ***p < 0,001). Los valores de p en (c) son (de izquierda a derecha) 0,013, 0,0003. Los datos se presentan como valores medios ± DE (n = 3 réplicas biológicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los resultados del cultivo mixotrófico confirmaron que el consumo de glucosa intracelular se evitó en PCC 7942 según el diseño. La suplementación con glucosa (30 mM) mejoró la producción de biomasa de la cepa SZ14 (que lleva el transportador GalP) en tres veces, mientras que no se detectó ninguna mejora en el crecimiento en la cepa deficiente en glucoquinasa, lo que indica una pérdida en la capacidad de utilización de glucosa (Fig. 1b ). Además, la suplementación de glucosa condujo a la recuperación de la actividad de glucocinasa en las cepas deficientes (Fig. 1c), lo que indica una respuesta adaptativa del metabolismo de PCC 7942 hacia la glucosa exógena, incluida la estimulación de actividades de glucocinasa no específicas.

Los resultados del ensayo enzimático indicaron que las actividades de la glucocinasa podrían ser esenciales para que las células PCC 7942 mantengan la homeostasis del metabolismo, mientras que la dependencia podría aliviarse parcialmente mediante la introducción del transportador de glucosa GalP. Dados los efectos de GalP en la dependencia de la glucoquinasa nativa, planteamos la hipótesis de que la deficiencia de glucoquinasa en PCC 7942 conduciría a una acumulación anormal de metabolitos específicos, que GalP podría exportar para aliviar la toxicidad potencial o el estrés por retroalimentación. Para probar esta hipótesis, investigamos los perfiles de metabolitos secretados de las cepas deficientes en glucocinasa (Fig. 3a complementaria) y descubrimos que se acumularon cantidades significativas de glucosa en el medio de cultivo. En las condiciones de cultivo adoptadas (medio BG11, 100 μmol de fotones/m2/s, burbujeo de aire para el suministro de carbono), SZ3 (WT-∆glk1-∆glk2) y SZ17 sintetizaron 1,0 g/L y 0,33 g/L de glucosa. cepa WT-∆glk1-∆glk2-∆NS3::galP) respectivamente (Fig. 2). Además, la acumulación de glucosa se produjo al mismo ritmo que la producción de biomasa celular, lo que indica que la glucosa extracelular fue sintetizada y secretada por las células vivas y no por el contenido de las células lisadas. Cuando se mejoraron aún más el suministro de carbono y la iluminación (3 % de CO2 v/v en el aire, 200 μmol de fotones/m2/s), la producción de glucosa de SZ3 y SZ17 aumentó a 1,64 g/l y 1,16 g/l, respectivamente; y también se mejoraron las tasas de acumulación de biomasa de las dos cepas. Durante el proceso, las concentraciones de glucosa intracelular en las cepas con deficiencia de glucoquinasa también aumentaron (Fig. 3b complementaria). En cuanto a SZ3, alrededor de 5,6 mg/L/OD730 de glucosa (más de 70 veces mayor que la del control) se acumularon dentro de las células el día 6, y para SZ17, la concentración de glucosa intracelular alcanzó hasta 2,8 mg/L/OD730 .

Se midieron y compararon las densidades celulares (a) y las concentraciones de glucosa extracelular (b) de las cepas SZ3 y SZ17 deficientes en glucoquinas. SZ3 y SZ17 se cultivaron en dos condiciones con diferentes intensidades de iluminación y suministro de carbono. Los símbolos vacíos y las líneas punteadas representan los perfiles de condiciones de cultivo de 30 °C, 100 µmol fotones/m2/s y aireado; y los símbolos sólidos y las líneas continuas representan perfiles de las condiciones de cultivo de 30 °C, 200 µmol fotones/m2/sy 3 % de CO2 aireado. Los datos se presentan como valores medios ± DE (n = 3 réplicas biológicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para excluir las contribuciones potenciales de la fuente de carbono orgánico en el medio BG11 a la síntesis de glucosa, eliminamos los componentes de citrato y citrato de amina férrica del medio, pero no encontramos ningún efecto negativo sobre la producción de glucosa, aunque el crecimiento celular de las cepas recombinantes disminuyó ligeramente ( Figura complementaria 4a-c). También realizamos cultivos de marcado de isótopos para evaluar las contribuciones de las fuentes de carbono orgánico. Como se muestra en la figura complementaria 4d-i, cuando las células de Synechococcus recombinantes se cultivaron con NaHCO3 marcado con 13C, la glucosa sintetizada se pudo marcar rápidamente con 13C, y la adición o eliminación de citrato y citrato de amina férrica causó impactos menores en las tasas de etiquetado. . Por lo tanto, podríamos proponer que la glucosa secretada por las cepas recombinantes provenía predominantemente de la conversión de dióxido de carbono inorgánico. En comparación con informes anteriores, en este trabajo se mejoró la producción fotosintética de glucosa por parte de las cianobacterias. Se logró una productividad de glucosa más de diez veces superior (0,27 g/L/OD730 frente a 0,027 g/L/OD730) sin la introducción o sobreexpresión de ninguna enzima catalítica en Synechococcus. Además, la síntesis de glucosa de PCC 7942 recombinante continuó durante la fase de crecimiento rápido independientemente de cualquier inducción de estrés ambiental (p. ej., estrés por sales o tratamiento oscuro)23,24. Además, la cepa SZ3 secretaba la mayor parte de la glucosa (>95 %, aproximadamente 0,27 g/L/OD730 frente a 5,6 mg/L/OD730) independientemente de los transportadores heterólogos, lo que sugiere que la deficiencia de glucocinasa activó mecanismos de transporte de glucosa desconocidos.

La glucosa generalmente no se reconoce como un metabolito intracelular principal en PCC 7942, por lo que no esperábamos que el bloqueo de la capacidad de consumo de glucosa desplazara una gran parte del flujo de carbono hacia la síntesis de glucosa. Teóricamente, la glucosa se puede generar a través de la desfosforilación de glucosa-1-fosfato o glucosa-6-fosfato catalizada por glucosa-1-fosfatasa (EC 3.1.3.10) o glucosa-6-fosfatasa (EC 3.1.3.9). Aunque estos genes no han sido identificados en PCC 7942, otras fosfatasas (fosfatasa alcalina, Synpcc7942_1392; difosfatasa inorgánica, Synpcc7942_1383; fructosa-1,6-bisfosfatasa II/sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Synpcc7942_0505; fructosa-1,6-bisfosfatasa , Synpcc7942_2335; mio-inositol-monofosfatasa, Synpcc7942_2582) podría catalizar las reacciones usando glucosa-1-fosfato o glucosa-6-fosfato como sustratos no específicos. Teniendo en cuenta la cantidad de glucosa acumulada, una vía más posible era la vía de hidrolización de la sacarosa, a través de la cual la UDP-glucosa y la fructosa-6-fosfato se convertirían en sacarosa catalizada por la sacarosa-6-fosfato sintasa (sps, Synpcc7942_0808), y la generada la sacarosa podría hidrolizarse en glucosa y fructosa (invA, Synpcc7942_0397) (Fig. 3a). Para confirmar esta hipótesis, eliminamos los dos genes (SZ130, SZ3-ΔinvA; SZ131, SZ3-Δsps; Figuras complementarias 5 y 6) y descubrimos que la tasa de crecimiento no se vio afectada mientras que la secreción de glucosa se redujo en aproximadamente un 90 %. a 0,2 g/L (Fig. 3b, c). El mismo fenómeno se observó para la cepa SZ17 (Fig. 3d).

a Red metabólica esquemática de generación de glucosa en PCC 7942. Crecimiento celular (b) y producción de glucosa (c) de SZ3, SZ130 (SZ3-ΔinvA) y SZ131 (SZ3-Δsps). d Producción de glucosa de SZ17 y SZ159 (SZ17-Δsps). El cultivo se llevó a cabo a 30 °C, 200 µmol fotones/m2/s, y se burbujeó con CO2 al 3 %. Los datos se presentan como valores medios ± DE (n = 3 réplicas biológicas). Ciclo CBB Ciclo de Calvin-Benson-Bassham, Fru-1,6-bisP fructosa-1,6-bisfosfato, Fru-6-P fructosa-6-fosfato, UDP-Glc UDP-glucosa, Suc-6-P sacarosa-6 -fosfato, Glc-6-P glucosa-6-fosfato, Glc-1-P glucosa-1-fosfato, Sps sacarosa-fosfato sintasa, Spp sacarosa-fosfato fosfatasa, Fk fructoquinasa, Pgi glucosa-6-fosfato isomerasa, Pgm fosfoglucomutasa , Fbp fructosa-1,6-bisfosfato I, Glpx fructosa-1,6-bisfosfatasa II/sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Galu UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los resultados indicaron que la vía de síntesis de sacarosa dominaba la acumulación de glucosa en las cepas deficientes en glucocinasa, lo que contradecía la intuición porque la síntesis de sacarosa suele reconocerse como un mecanismo protector fisiológico inducible para resistir el estrés hipersalino31. Para investigar si se mantuvo un flujo metabólico significativo a través de la vía de síntesis de sacarosa en las cepas deficientes en glucocinasa independientemente de la inducción de estrés hipersalino, construimos una cepa derivada de SZ130, a saber, SZ153, que lleva un transportador heterólogo de sacarosa sacarosa-protón permeasa (CscB) (Suplementario Figs. 7a, b), en las que la deficiencia de invA bloquearía la potencial hidrolización de sacarosa, y la expresión de cscB inducida por isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) podría facilitar la secreción de sacarosa acumulada (Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, en condiciones estándar, no hubo una diferencia significativa entre la glucosa extracelular producida por las dos cepas, mientras que la sacarosa se secretó continuamente solo en SZ153 (a 350 mg/l en 8 días) con expresión de cscB inducida por IPTG. Al expresar CscB, la concentración intracelular de sacarosa en SZ153 también disminuyó de 10 mg/L/OD730 a aproximadamente 2 mg/L/OD730, mientras que la concentración de glucosa intracelular no se vio afectada (Figuras complementarias 7c, d). Por lo tanto, se pudo confirmar que se mantuvo un flujo de síntesis de sacarosa en las células PCC 7942 independientemente del estrés hipersalino.

a Estrategias de ingeniería para facilitar la secreción de sacarosa en PCC 7942. b Secreción de sacarosa/glucosa en SZ130 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA) y SZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB) con o sin inducción de IPTG. c Acumulaciones extracelulares de glucosa y sacarosa de FL92 (ΔNS3::cscB), SZ21 (ΔinvA-ΔNS3::cscB) y SZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB) con o sin inducción de IPTG. Las células se cultivaron en BG11 durante 8 días. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Todo el tamaño de muestra n (repeticiones biológicas) es 6. Glk√ y Glk×: glucoquinasa intacta y deficiente, respectivamente; IPTG√: cepa cultivada en presencia de IPTG 0,1 mM; IPTG×: no se añadió IPTG al medio BG11; CscB×: no hay CscB en la cepa; CscB√: cepa que expresa CscB; Invertasa √ e Invertasa×: invertasa intacta y deficiente, respectivamente; Ciclo CBB Ciclo de Calvin-Benson-Bassham, Fru-1,6-bisP fructosa-1,6-bisfosfato, Fru-6-P fructosa-6-fosfato, UDP-Glc UDP-glucosa, Suc-6-P sacarosa-6 -fosfato, Glc-6-P glucosa-6-fosfato, Glc-1-P glucosa-1-fosfato, Sps sacarosa-fosfato sintasa, Spp sacarosa-fosfato fosfatasa, Fk fructocinasa, CscB sacarosa permeasa, Pgi glucosa-6-fosfato isomerasa, Pgm fosfoglucomutasa, Fbp fructosa-1,6-bisfosfato I, Glpx fructosa-1,6-bisfosfatasa II/sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Galu UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Otros experimentos revelaron que la síntesis activa de sacarosa en PCC 7942 no estaba relacionada con la deficiencia de glucocinasa. La secreción de sacarosa a través de CscB en condiciones no hipersalinas también se observó para el fondo de tipo salvaje. En la cepa FL92 construida previamente (WT-ΔNS3::Plac-cscB)32, la expresión de cscB inducida por IPTG mejoró la secreción de sacarosa extracelular. La inactivación de invA (denominada SZ21, figura complementaria 8) mejoró la secreción de sacarosa de 16 a 80 mg/l cuando no se añadió IPTG (cscB expresada en un estado "permeable"). Cuando se añadió IPTG 0,1 mM, la secreción de sacarosa de las tres cepas aumentó aún más a más de 190 mg/L, y se observó menos secreción de glucosa en las cepas SZ21 y FL92 con glucoquinasas funcionales (Fig. 4c). En base a los resultados anteriores, asumimos que existía un ciclo metabólico de sacarosa activo en PCC 7942 y que la deficiencia de glucocinasa bloqueaba la reutilización de glucosa y promovía aún más la acumulación y secreción subsiguientes. En las cepas deficientes en el metabolismo de la sacarosa, todavía se sintetizó una cierta cantidad de glucosa, lo que indica que había vías adicionales que contribuyen a la síntesis de glucosa (p. ej., actividad potencial de desfosforilación no específica) en PCC 7942.

La deficiencia de glucoquinasa dio como resultado la acumulación intracelular de glucosa, mientras que los mecanismos que facilitan la posterior secreción independiente de los transportadores heterólogos quedan por revelar. En la cepa SZ17 deficiente en glucocinasa, la glucosa generada podría exportarse fuera de las células a través del transportador de glucosa heterólogo GalP, evitando la sobreacumulación de glucosa intracelular. En comparación, con respecto a la cepa SZ3, se requerirían mutaciones genómicas para facilitar la secreción de glucosa, lo que también podría ser una explicación de los pasajes a largo plazo necesarios para el aislamiento de los homocigotos. Con este fin, se realizó la secuenciación del genoma completo para identificar las mutaciones funcionales que facilitan la secreción de glucosa en SZ3. Con base en la información genómica publicada de PCC 7942 (FACHB-805), se caracterizaron los tipos de mutaciones en el genoma de SZ3 y SZ17 (Tabla complementaria 1), la mayoría de las cuales se generaron durante la conservación y los pases de la cepa PCC 7942 en nuestro laboratorio. y fueron identificados previamente a través de ensayos de secuenciación del genoma. A través de las comparaciones entre SZ3 y SZ17, se identificó un SNP específico (G274A) en el gen synpcc7942_1161 del genoma SZ3, en el que la valina 92 ​​se convirtió en isoleucina (Fig. 5a). La eliminación de synpcc7942_1161 (G274A) en la cepa SZ3 (SZ141, Fig. 9 complementaria) redujo la secreción de glucosa en un 78 % a 0,33 g/l, lo que demuestra el papel esencial de este gen (Fig. 5b).

una secuenciación de ADN de Sanger de la región del gen synpcc7942_1161 amplificada de SZ3 y SZ17. b Efecto de la deficiencia del gen synpcc7942_1161 sobre la secreción de glucosa de la cepa SZ3. c La estrategia de construcción de la cepa SZ182 mediante la introducción de la mutación synpcc7942_1161-G274A en el genoma de PCC 7942; SZ181 que lleva el mismo marcador de resistencia a antibióticos insertado se usó como cepa de control. Los números indican los pliegues elevados de las abundancias de transcritos respectivos en SZ182 en comparación con SZ181. d Efecto de sobreexpresión de synpcc7942_1161 (SZ192) sobre la producción de glucosa de la cepa SZ17. e La estrategia de construcción para reemplazar el gen galP en SZ17 con synpcc7942_1161 (con o sin mutación G274A). f Comparaciones de los efectos de synpcc7942_1161 y synpcc7942_1161-G274A en la promoción de la secreción de glucosa cuando se usa para reemplazar GalP en el cromosoma de SZ17. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Todo el tamaño de muestra n (repeticiones biológicas) en (b, d y f) es 3. Todo el tamaño de muestra n (replicas biológicas) en (c) es 6. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Synpcc7942_1161 se anotó para codificar un transportador de metal divalente con cinco dominios transmembrana (Fig. 10 complementaria). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la mutación G274A podría mejorar las afinidades de la glucosa con el exportador de la membrana interna Synpcc7942_1161, facilitando así una secreción de glucosa más eficiente en la cepa SZ3. Sin embargo, un ensayo de transcriptoma posterior sugirió efectos más complejos de la mutación synpcc7942_1161-G274A. Y entre las transcripciones con abundancias significativamente elevadas en la cepa SZ3, la transcripción synpcc7942_1161 fue la más regulada al alza, alcanzando un aumento de hasta 77 veces. Además, otros cuatro genes ubicados en el mismo operón con synpcc7942_1161 también estaban significativamente regulados (synpcc7942_1160 por 37 pliegues, synpcc7942_1162 por 59 pliegues, synpcc7942_1163 por 37 pliegues y synpcc7942_RS13740 por 34 pliegues), constituyendo el las cinco mejores transcripciones reguladas al alza en SZ3. Para explorar si las transcripciones elevadas fueron causadas por la mutación synpcc7942_1161-G274A, introdujimos esta mutación en el genoma PCC 7942 WT (Fig. 5c y Fig. 11 complementaria) y examinamos los cambios en el transcriptoma. Los resultados revelaron que la mutación synpcc7942_1161-G274A aumentó significativamente la abundancia de transcripción de tres proteínas transportadoras potenciales que codifican genes (Fig. 5c y Datos complementarios 1), lo que sugirió que las expresiones mejoradas del operón probablemente fueron causadas por esta mutación.

La abundancia de Synpcc7942_1161 pareció determinar los fenotipos de secreción de glucosa porque la sobreexpresión del gen de tipo salvaje en la cepa SZ17 (SZ192, Fig. 5d y Fig. 12 complementaria) aumentó la producción de glucosa al nivel de SZ3. Además, reemplazamos GalP en el cromosoma de SZ17 con synpcc7942_1161 de tipo salvaje y una versión mutada synpcc7942_1161-G274A, obteniendo JS155 y JS156, respectivamente (Fig. 5e). Como se muestra en la Fig. 5f, JS155 y JS156 secretaron cantidades comparables de glucosa en el caldo de cultivo, las cuales fueron más altas que SZ17. Y las concentraciones de glucosa intracelular en las dos cepas también mejoraron ligeramente. Por lo tanto, también se puede proponer que la mutación synpcc7942_1161-G274A promovió la secreción de glucosa (en SZ3) principalmente elevando la abundancia de transcritos de synpcc7942_1161 en lugar de optimizar las actividades específicas del transportador respectivo. Además, evaluamos y comparamos más la estabilidad del ARNm de synpcc7942_1161 en JS155 y JS156 bajo el control del promotor Plac, y no se encontraron diferencias entre las dos versiones de ARNm de synpcc7942_1161 con o sin la mutación G274A (Fig. 13 complementaria). Por lo tanto, podría especularse que las abundancias elevadas de transcripciones de synpcc7942_1161 se debieron al aumento de las actividades de transcripción en lugar de la optimización de la estabilidad de la transcripción. También asumimos que el synpcc7942_1161 mutado podría contribuir a una función de transporte unidireccional de glucosa intracelular porque la cepa PCC 7942 WT que porta la mutación synpcc7942_1161-G274A no podía absorber glucosa (Fig. 14 complementaria). En base a los resultados anteriores, asumimos un modelo para la generación de la cepa SZ3 deficiente en glucocinasa. Como se muestra en la Fig. 6, la deficiencia de glucoquinasa bloqueó el ciclo glucosa-6-fosfato ↔ glucosa y enriqueció la mutación espontánea de synpcc7942_1161-G274A. El synpcc7942_1161-G274A podría promover la secreción de glucosa al aumentar la abundancia o la actividad del exportador de la membrana interna Synpcc7942_1161, que inició las secreciones de glucosa de manera más eficiente. Finalmente, las secreciones elevadas de glucosa amortiguaron el posible estrés por retroalimentación y permitieron el aislamiento del homocigoto final de SZ3.

Ciclo CBB Ciclo de Calvin-Benson-Bassham, Fru-1,6-bisP fructosa-1,6-bisfosfato, Fru-6-P fructosa-6-fosfato, UDP-Glc UDP-glucosa, Suc-6-P sacarosa-6 -fosfato, Glc-6-P glucosa-6-fosfato, Glc-1-P glucosa-1-fosfato, Sps sacarosa-fosfato sintasa, Spp sacarosa-fosfato fosfatasa, Fk fructoquinasa, 1161: gen synpcc7942_1161, Pgi glucosa-6- fosfato isomerasa, Pgm fosfoglucomutasa, Fbp fructosa-1,6-bisfosfato I, Glpx fructosa-1,6-bisfosfatasa II/sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Galu UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa.

El análisis global de secuenciación de ARN reveló que el transcriptoma se remodeló en SZ3, y las expresiones de 581 genes se regularon significativamente (227 regulados al alza y 354 regulados a la baja, Datos complementarios 2) en comparación con WT. El análisis de enriquecimiento reveló que las vías involucradas en la fotosíntesis y la fosforilación oxidativa estaban significativamente reguladas (valor de p < 0,01) en SZ3 (Fig. 15 complementaria), y eso era coherente con las actividades de fotosíntesis debilitadas (tasas de evolución de oxígeno; Fig. 16 complementaria) en SZ3 en comparación con WT. Mientras tanto, muchos genes que participan en el metabolismo del nitrógeno y el metabolismo de los aminoácidos en SZ3 también muestran cambios en los niveles de transcripción, que se asociaron con el estado activo de "derrame de carbono" en la cepa con deficiencia de glucoquinasa, especialmente para aquellos estrechamente asociados con el metabolismo del nitrógeno. Para dilucidar aún más los efectos del metabolismo de la deficiencia de glucoquinasa, se realizaron ensayos de metabolómica no dirigidos entre SZ3 y el tipo salvaje. A través de ensayos LC-MS/MS, se identificaron 116 metabolitos diferenciados (Datos complementarios 3, 4). De acuerdo con el cambio en el transcriptoma, se cambiaron varias concentraciones de aminoácidos dentro de SZ3. Por ejemplo, las concentraciones de arginina, glutamato y glutamina, que intervienen en el ciclo ornitina-amoníaco33, se redujeron en más del 50 % (Fig. 7). Otra característica metabolómica representativa de la cepa SZ3 deficiente en glucocinasa fue el aumento de la abundancia de compuestos de azúcar y la disminución del contenido de metabolitos fosforilados (Tablas complementarias 2 y 3). Este fenómeno indicó que las glucocinasas podrían funcionar como fosforilasas no específicas con sustratos más amplios en el metabolismo de PCC 7942, lo que también podría explicar la dificultad para aislar los homocigotos deficientes en glucocinasa. Para confirmar esta hipótesis, purificamos Glk1 y Glk2 de PCC 7942 y evaluamos las actividades de las dos enzimas en la fosforilación de azúcares distintos de la glucosa. Como se muestra en la Fig. 17 complementaria, ambas glucoquinasas mostraron actividades de fosforilación en algunos otros azúcares además de la glucosa. Las actividades inespecíficas de Glk2 hacia los ocho azúcares superan el 20 % (de la actividad específica para la glucosa), alcanzando hasta el 50 % para la fructosa, manosa y galactosa. Los resultados del ensayo in vitro proporcionaron evidencia adicional para la hipótesis de que las glucocinasas pueden desempeñar un papel importante en la fosforilación y el reciclaje de azúcares en PCC 7942. Además, varios metabolitos fosforilados con concentraciones reducidas (ribulosa-5-fosfato, dihidroxiacetona fosfato, fructosa-6- fosfato y eritrosa-4-fosfato) están involucrados en el ciclo CBB (Fig. 7), por lo que la disminución de la abundancia también podría ser el resultado de la privación del flujo de carbono causada por la síntesis y secreción de glucosa.

Cantidades relativas de metabolitos intracelulares de WT (columna blanca) y SZ3 (columna gris) cultivados en condiciones de cultivo estándar (medio BG11, 100 μmol de fotones/m2/s, burbujeo de aire para suministro de carbono) durante 8 días. Los metabolitos de SZ3 que aumentaron o disminuyeron significativamente en comparación con WT están etiquetados en rojo y azul, respectivamente. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Todo el tamaño de muestra n (repeticiones biológicas) es 6. Ciclo CBB Ciclo de Calvin-Benson-Bassham, ciclo TCA ciclo del ácido tricarboxílico, vía ED vía Entner-Doudoroff, FBP fructosa-1,6-bisfosfato, Fbp fructosa-1,6-bisfosfato I, Glpx fructosa-1,6-bisfosfatasa II/sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Galu UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, F6P fructosa-6-fosfato, UDP-Glc UDP-glucosa, Suc-6-P sacarosa -6-fosfato, G6P glucosa-6-fosfato, G1P glucosa-1-fosfato, Sps sacarosa-fosfato sintasa, Spp sacarosa-fosfato fosfatasa, Fk fructocinasa, Glk glucocinasa, E4P eritrosa-4-fosfato, SBP sedoheptulosa-1,7 -bisfosfato, S7P sedoheptulosa-7-fosfato, GAP gliceraldehído-3-fosfato, R5P ribosa 5-fosfato, Xu5P xilulosa-5-fosfato, Ru5P ribulosa-5-P, Ru15P ribulosa-1,5-difosfato, DHAP dihidroxiacetona fosfato, ADP-Glc adenosina difosfato glucosa, Pgm fosfoglucomutasa, Pgi glucosa-6-fosfato isomerasa, 3PGA 3-fosfato-glicerato, 6PG ácido 6-fosfoglucónico, KDPG 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, PYR piruvato, Glu15La Glucono- 1,5-lactona, UDP-Gal UDP-galactosa, Gal galactosa, Gal-1P Galactosa 1-fosfato, PEP fosfoenolpiruvato, AcCoA acetil-CoA, CIT citrato, ICIT isocitrato, 2OG 2-oxoglutarato, SUC-CoA succinil CoA, SUC succinato, fumarato FUM, oxaloacetato OAA, malato MAL. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Con respecto a la ruta del metabolismo de la sacarosa que apoya directamente la síntesis de glucosa, la abundancia de los metabolitos intermedios importantes se reguló de manera diferente, lo que indica una ruta catalítica desequilibrada (Fig. 7). En comparación con el control de tipo salvaje, la concentración de sacarosa intracelular disminuyó un 74,3 %, mientras que la de fructosa aumentó ocho veces. Estos resultados indican una fuerte fuerza impulsora para la secreción de glucosa y una mayor producción de fructosa, que superó la capacidad de conversión de la fructoquinasa nativa. Las concentraciones de la mayoría de los metabolitos aguas arriba generalmente disminuyeron (en un 88,3 % para glucosa-1-fosfato, 88,4 % para glucosa-6-fosfato, 69,9 % para fructosa-1,6-bisfosfato y 97,7 % para fructosa-6-fosfato), excepto UDP-glucosa (aumento de 2,93 veces). Las enzimas funcionales responsables de la conversión de glucosa-1-fosfato en UDP-glucosa no se identificaron en PCC 794234. Por lo tanto, los mecanismos que causan la sobreacumulación de UDP-glucosa deben investigarse más a fondo en estudios futuros.

Para mejorar aún más la producción fotosintética de glucosa, se sobreexpresaron individualmente varias enzimas esenciales de las vías del metabolismo de la sacarosa. Como se muestra en la Fig. 8, la sacarosa-6-fosfato sintasa/sacarosa-6-fosfotasa bifuncional (que cataliza la síntesis de sacarosa-6-fosfato y sacarosa a partir de fructosa-6-fosfato y UDP-glucosa), la invertasa (que cataliza la degradación de la sacarosa en fructosa y glucosa), la fosfoglucosa isomerasa (que cataliza la conversión entre fructosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato), la fosfoglucosa mutasa (que cataliza la conversión entre glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato) , la fructosa-1,6-bisfosfatasa (que cataliza la conversión de fructosa-1,6-bifosfato en fructosa-6-fosfato) se sobreexpresaron individualmente en la cepa SZ3. La mayoría de las cepas recombinantes mejoraron la producción de glucosa, mejorando las concentraciones de glucosa extracelular de aproximadamente 1,6 a 2 g/l durante un proceso de cultivo de 16 a 18 días. La única excepción fue la sobreexpresión de fructoquinasa, por lo que disminuyó la secreción de glucosa. Una posible explicación es que el aumento de las enzimas de fructocinasa cataliza la glucosa como sustrato no específico y restablece el ciclo de glucosa/fosfoglucosa previamente bloqueado (Fig. 18 complementaria), lo que conduce a la reducción de la rama de síntesis de glucosa.

Producción de glucosa extracelular y densidad celular de cepas mutantes calculadas después de un cultivo de 15 a 18 días. Los resultados para SZ145 y SZ150 son la producción de glucosa extracelular desde el día 16 y 15 de cultivo, respectivamente. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas (**p < 0,01, ****p < 0,0001). Los valores p son (de izquierda a derecha) 0,0029, 0,0026, 0,0011, 0,0049, <0,0001, 0,0017, <0,0001. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Todo el tamaño de muestra n (repeticiones biológicas) es 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se mencionó anteriormente, la optimización del suministro de carbono y la iluminación mejoraron la producción de glucosa de las cepas SZ3 y SZ17, así como las tasas de acumulación de biomasa. Utilizamos la cepa SZ123 para mejorar la producción de glucosa mediante la optimización del cultivo, y los resultados mostraron una producción mejorada de biomasa y glucosa (de 2 a 2,9 g/L; Fig. 9a; Fig. 19 complementaria) utilizando medio de cultivo BG11 concentrado (2x)35. Para la síntesis prolongada de glucosa, adoptamos una estrategia de alimentación por lotes al volver a suspender las células sintetizadoras de glucosa (es decir, recolectar las células y suspenderlas con medio fresco) cada 12 días. Esta estrategia prolongó efectivamente las actividades de síntesis de glucosa de las células SZ123 (Fig. 9b) y condujo a la acumulación de 5 g/L de glucosa después de 3 lotes, lo que absorbió más del 70 % del flujo de carbono fijado por las células recombinantes de Synechococcus ( Figura complementaria 20). Las tasas de acumulación de glucosa disminuyeron gradualmente con la disminución de la densidad celular. Por lo tanto, la robustez celular de las fábricas de células recombinantes para mantener un crecimiento y un metabolismo estables en el cultivo a largo plazo es el factor principal para el control de la producción de glucosa. En consecuencia, las futuras soluciones sistemáticas para la ingeniería de cepas y cultivos deberían mejorar aún más estos aspectos.

a Efecto de la suplementación con medios de cultivo sobre la producción de glucosa de la cepa SZ123. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Los valores de p son (de izquierda a derecha) 0,0001, <0,0001. b Cultivo continuo de resuspensión de la cepa SZ123 basado en (2x) medio BG11. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Todo el tamaño de muestra n (repeticiones biológicas) en (a) es 4. Todo el tamaño de muestra n (replicas biológicas) en (b) es 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En este trabajo, desbloqueamos el potencial de la fotosíntesis de cianobacterias para convertir el dióxido de carbono directamente en glucosa. La fotosíntesis es el proceso bioquímico más extenso de la Tierra, y los fotoautótrofos convierten la energía solar y el dióxido de carbono en carbono orgánico primario para apoyar el mantenimiento de la biosfera36. Actualmente, la refinación de biomasa vegetal/algal rica en azúcar sirve como la ruta dominante para producir azúcar en grandes cantidades, satisfaciendo las necesidades de las áreas de alimentos y medicamentos, así como de la industria de la biorrefinería8,9. El modo de producción fotosintética de cianobacterias de "una olla, un paso" podría servir como una alternativa de azúcar más continua, estable y eficiente que la ruta "plantas-biomasa-azúcar"37. La mayoría de las especies de cianobacterias pueden sintetizar y acumular naturalmente solutos compatibles de tipo azúcar para resistir el estrés ambiental abiótico38. La acumulación y secreción de estos compuestos de azúcares compatibles (como la sacarosa y la trehalosa) por parte de las cianobacterias se puede optimizar a través de la manipulación genética20,21, y se exploran y amplían escenarios de aplicación biotecnológica como el desarrollo de consorcios artificiales39,40. Sin embargo, la glucosa, la molécula de monosacárido más representativa e importante, no puede sintetizarse y acumularse eficientemente en las cianobacterias. Recientemente, se ha observado secreción de glucosa (acompañada de secreción de sacarosa) en un mutante PCC 7942 con el gen xpk eliminado (que codifica fosfocetolasa). Sin embargo, esta síntesis de glucosa solo puede desencadenarse en la oscuridad con condiciones de estrés por sales, y el título es bastante limitado, alcanzando aproximadamente 3 mM por células de alta densidad (la OD730 inicial es 20 y la productividad promedio final de 0,027 g/L /OD730)24. En otro trabajo informado anteriormente, el título de síntesis de glucosa inducida por sal (acompañada de secreción de fructosa) alcanzó solo 30 μM (productividad de 0,027 g/L/OD750) en PCC 7942 al sobreexpresar los transportadores de sacarosa hidrolasa y hexosa23. Por el contrario, en este trabajo se logró la síntesis continua de glucosa durante la fase de crecimiento fotoautotrófico rápido, con una productividad superior a 0,27 g/L/OD730, simplemente eliminando las actividades de glucocinasa en las células de Synechococcus, lo que significa productividades fotosintéticas diez veces mayores en ausencia de cualquier actividad. enzimas catalíticas heterólogas o transportadores e independientes de cualquier inducción de estrés ambiental.

Aunque la mayoría de las especies de cianobacterias aisladas realizan un metabolismo autotrófico y son deficientes para absorber y utilizar glucosa exógena como fuente de carbono, algunas cepas de cianobacterias son capaces de utilizar glucosa41,42. En cuanto a las cepas de cianobacterias capaces de realizar un metabolismo heterótrofo o mixotrófico utilizando glucosa, la glucoquinasa juega un papel fundamental en la fosforilación de la glucosa e iniciación de los diversos procesos glucolíticos43,44. Sin embargo, los genes de glucoquinasa son ubicuos en la gran mayoría de los genomas de cianobacterias secuenciados (Datos complementarios 5). Por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC 7942, que se ha demostrado que carece de la capacidad de absorber y utilizar glucosa exógena, tiene dos genes de glucoquinasa en su genoma, lo que implica que la glucoquinasa tiene más funciones fisiológicas que la utilización de glucosa. A través de modificaciones genéticas sistemáticas, identificamos un ciclo de glucosa-fosfoglucosa activo y estable en PCC 7942, que se mantuvo en la ruta del metabolismo de la sacarosa. Anteriormente, la síntesis y la acumulación de sacarosa se reconocían generalmente como un mecanismo de respuesta al estrés salino para resistir el estrés hiperosmótico31,45. Por el contrario, demostramos en este trabajo que el ciclo de síntesis-degradación de la sacarosa en PCC 7942 permanece activo independientemente de la inducción del estrés por sales, y la actividad de la glucoquinasa actúa como una "compuerta" para evitar la sobreacumulación de glucosa, que es un intermediario en la red metabólica de la sacarosa y tiene un impacto potencial en el metabolismo fotosintético. Además del metabolismo de la sacarosa, algunas otras reacciones no específicas también pueden contribuir a la síntesis y acumulación de glucosa en PCC 7942. Por lo tanto, podría suponerse que la síntesis de glucosa intracelular puede mantenerse continuamente en PCC 7942, mientras que la glucoquinasa fue crucial para reciclar la glucosa en la red metabólica central por un proceso de fosforilación, y este mecanismo puede rescatar potencialmente la pérdida potencial de energía y la alteración del metabolismo causada por la secreción y acumulación de glucosa. Además, aunque el crecimiento celular y la fotosíntesis no se inhibieron (Fig. 16 complementaria), las cepas deficientes en glucocinasa mostraron una sensibilidad mejorada a NaCl 150 mM (Fig. 21 complementaria), lo que indica que el ciclo estable de glucosa-fosfoglucosa contribuye a la respuesta rápida de PCC 7942 hacia el estrés salino. Previamente se ha demostrado que el efecto iónico es importante para inducir la acumulación de sacarosa en PCC 7942, por lo que una concentración elevada de iones activa directamente la enzima sintetizadora de sacarosa Sps y simultáneamente inhibe la enzima degradadora de sacarosa Inv31. El mantenimiento del ciclo del metabolismo de la sacarosa permitió la regulación directa de la actividad de las concentraciones de iones en las enzimas, y las actividades de la glucocinasa podrían garantizar la rápida reutilización de los azúcares (fructosa y glucosa) de la sacarosa hidrolizada (la actividad de Inv se reduciría en lugar de reducirse). eliminado completamente por concentraciones elevadas de iones).

Un tema importante en la ingeniería metabólica microbiana es la adaptación de las células del chasis a vías artificiales y modificaciones genómicas. Las actividades metabólicas conectadas y reconectadas pueden alterar la distribución de carbono, el suministro de cofactores y los equilibrios redox del metabolismo celular nativo, y son propensos a estimular las respuestas de las células huésped en los niveles fisiológicos, metabólicos e incluso genéticos46, que debe aliviarse mediante diseños e ingeniería metabólicos. La ingeniería de transportadores se ha convertido en una estrategia universal para aumentar la adaptabilidad de las células del chasis microbiano a vías heterólogas, lo que podría promover la secreción de productos, aliviar la carga metabólica de la sobreacumulación intracelular y reducir el efecto inhibidor potencial de los productos47. En este estudio se sugirió una solución alternativa. Para lograr un transporte de glucosa efectivo, introdujimos un transportador heterólogo GalP en el cromosoma de PCC 7942, que redujo el estrés metabólico o fisiológico intracelular potencial y facilitó la adquisición conveniente y sin problemas de los transformantes genéticos (SZ17). En comparación, sin introducir transportadores heterólogos, se generó y enriqueció una mutación espontánea (Synpcc7942_1161-G274A) durante el proceso de cultivo a largo plazo y dotó a la cepa mutante de capacidades aún mejores para la síntesis y secreción de glucosa. La combinación de modificaciones genéticas artificiales con mutaciones genómicas espontáneas inducidas por el estrés metabólico podría reconfigurar el flujo metabólico de manera más efectiva.

En resumen, identificamos los factores clave que restringen el potencial natural de las cianobacterias para la producción fotosintética de glucosa. Sin catálisis heteróloga o genes de transporte, una gran parte del dióxido de carbono fijado fotosintéticamente en la cepa diseñada con actividades de glucoquinasa deficientes y una mutación genómica espontánea se reconectó a la producción secretora de glucosa. Los descubrimientos arrojan luz sobre el desarrollo y la industrialización de sistemas de producción de glucosa más direccionales y continuos con energía solar y dióxido de carbono.

Todos los genes endógenos se amplificaron por PCR a partir del genoma de PCC 7942 de tipo salvaje utilizando cebadores específicos de genes y ADN polimerasa de alta fidelidad (TransGen, Beijing, China). Todos los cebadores utilizados en este estudio y los plásmidos construidos se enumeran en Datos complementarios 6. Se utilizó la cepa DH5α de E. coli para construir los plásmidos, y todas las cepas se cultivaron a 37 °C en el medio Luria-Bertani (líquido o agar petri). plato) complementado con los antibióticos correspondientes (Solarbio). Se utilizaron ampicilina, kanamicina, espectinomicina, gentamicina y cloranfenicol a 100, 50, 50, 40 y 50 µg/ml, respectivamente, para las cepas con los genes de resistencia correspondientes. Todos los vectores principales se definieron en función de pUC19 o pBR322 mediante la inserción de regiones homólogas, promotores y casetes de resistencia a antibióticos con digestión con enzimas de restricción y ligamiento o clonación continua. Las regiones de recombinación homóloga en todos los plásmidos se ubicaron en aproximadamente 1000 pb en la secuencia aguas arriba y 1000 pb en la secuencia aguas abajo del locus del gen integrado. EcoRI, XbaI, EcoRV, NaeI, EagI y BamHI fueron los sitios de clonación de restricción usados ​​para construir pSS1 y pSS2. Todas las enzimas de restricción eran enzimas de digestión rápida de Thermo Fisher Science (Shanghai, China). Los plásmidos se construyeron utilizando el método de clonación sin costuras y el kit de clonación de ensamblaje sin costuras (Taihe Biology Co., LTD, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias de E. coli con plásmidos positivos se confirmaron mediante PCR de colonias utilizando cebadores específicos de genes y ADN polimerasa Taq (TransGen Biotech). Los plásmidos purificados con un kit Mini-prep (OMEGA Bio-Tek) se comprobaron mediante secuenciación Sanger antes de la transformación PCC 7942.

Las modificaciones genéticas del genoma de PCC 7942 se realizaron utilizando un sistema de recombinación homóloga doble para integrar los genes en los sitios diana. Todos los plásmidos se transformaron en PCC 7942 a través de la transformación natural. Los transformantes cultivados en placas selectivas de antibióticos se analizaron mediante PCR y secuenciación de ADN de segunda generación de los fragmentos amplificados32. Las cepas derivadas de PCC 7942 construidas en este estudio se enumeran en Datos complementarios 7.

Las cepas derivadas de PCC 7942 se inocularon en medio líquido BG11 que contenía los antibióticos correspondientes y se cultivaron durante 4 a 6 días con agitación rotatoria (150 rpm) e iluminación con luz blanca de 50 µmol fotones/m2/s a 30 °C. Posteriormente, el caldo de cultivo se inoculó en 200 mL de medio BG11 en matraces de 250 mL bajo luz blanca continua de 100 µmol fotones/m2/s y se burbujeó con aire. Se añadieron al medio kanamicina, espectinomicina, gentamicina y cloranfenicol para concentraciones finales de 20, 20, 2 y 10 µg/ml, respectivamente. Finalmente, el caldo de cultivo de los matraces se centrifugó y se resuspendió con 65 ml de medio de cultivo BG11 fresco hasta la OD730 inicial de aproximadamente 2,0 en fotobiorreactores de columna (con un diámetro de 3 cm). Excepto cuando se indique específicamente, los cultivos para la producción de glucosa fotosintética se realizaron a 30 °C. Durante el experimento de cultivo a largo plazo, se eliminaron los antibióticos, se añadió TES-NaOH 8 mM (pH = 8) para mantener el pH del cultivo y se comprobaron los genotipos de las células mediante PCR al final del cultivo. Durante el proceso de cultivo, se tomaron muestras de 0,5 ml de caldo de cultivo de cada fotobiorreactor de columna cada dos días para medir las concentraciones de glucosa y OD730, y se complementó con agua esterilizada para mantener el volumen original. Para experimentos especiales, los contenidos de carbono orgánico (ácido cítrico y citrato de amonio férrico) se eliminarían del medio BG11.

Para determinar el contenido de glucosa extracelular secretada por las cepas derivadas de PCC 7942, se tomaron muestras del caldo de cultivo y se centrifugaron a 12.000 ×g durante 1 min. Luego se calcularon las concentraciones de glucosa en el sobrenadante utilizando el kit de ensayo de D-glucosa (Megazyme) o el sistema de cromatografía de intercambio iónico ICS5000+ (DIONEX, Thermo Scientific, EE. UU.) equipado con un detector electroquímico y una columna analítica Dionex CarboPac MA1 (4×250 mm, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La glucosa intracelular se extrajo de los gránulos celulares siguiendo un estudio previo48. En resumen, los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de etanol al 80 % (volumen a volumen) y luego se incubaron a 65 °C durante 4 h. Después de centrifugar a 12.000 ×g durante 5 min, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y se secó bajo una corriente de N2 a 55 °C. Posteriormente, los residuos secos se disolvieron en agua ultrapura y la solución disuelta se filtró en viales limpios con una membrana de filtración de 0,22 μm. Los contenidos de glucosa en el filtrado también se calcularon usando el kit de ensayo de D-glucosa (Megazyme) o cromatografía iónica.

La actividad de la glucocinasa se midió mediante un ensayo modificado ligado a enzimas3. Las células de Synechococcus cultivadas en medio BG11 se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de tampón de rotura (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) enfriado previamente a 4 °C. Se añadió arena de cuarzo (Sigma) a la suspensión celular y las células se rompieron mediante agitación vorticial a 4 °C durante 30 min. Después de la centrifugación, se transfirieron 60 µL del sobrenadante a una placa de 96 pocillos, a los que se agregaron 200 µL de un tampón de reacción (Tris-HCl 100 mM, pH 7,8, ATP 2,5 mM, MgCl2 4 mM, KCl 20 mM, NADP+ 0,2 mM). , glucosa 10 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5 U/mL) y se midió la absorbancia a 340 nm cada 5 min en la oscuridad. Se calculó la pendiente de A510, que aumentaba con el tiempo, y se calculó la actividad enzimática específica de la glucocinasa en la mezcla de reacción según la ley de Lambert-Beer.

Los experimentos de marcado con 13C se realizaron utilizando bicarbonato de sodio marcado con 13C (Cambridge Isotope Laboratories, 99% 13C, CLM-441) y se añadió 12C-NaHCO3 como control. En primer lugar, las células en la fase de crecimiento exponencial se ajustaron a una DO730 de 0,6 en 10 ml de BG11 que incluían NaHCO3 50 mM y antibióticos apropiados, y luego se cultivaron en matraces sellados de 30 ml (sin espacio de cabeza) con o sin ácido cítrico y citrato férrico amónico bajo condiciones de luz continua. Para los ensayos de los metabolitos intracelulares, las células se recolectaron por centrifugación cada 24 h, se extrajeron rápidamente con 2 ml de metanol/agua 80:20 (vol/vol) y luego se congelaron en nitrógeno líquido. Los metabolitos intracelulares se extrajeron mediante el ciclo de congelación/descongelación cinco veces. Después de la centrifugación y el soplado de nitrógeno, se añadieron 100 µL de ddH2O a la muestra para resuspensión y se tomó para la reacción de derivatización. La derivatización de la muestra se llevó a cabo en dos pasos: (1) agregar 40 µL de solución de metoxiamina (25 mg/mL, disueltos en solvente de piridina) y luego incubar a 60 °C durante 30 min. (2) Se añadieron 40 µL de reactivo TMS (BSTFA/TMCS, 99:1) a cada muestra y luego se hizo reaccionar a 37 °C durante 120 min. Para los ensayos de glucosa extracelular, se tomaron 100 µl de sobrenadante de caldo de cultivo SZ3 para liofilización y derivatización, respectivamente. Después de la centrifugación, se realizó GC-MS para analizar las muestras. Los ensayos de GC-MS se realizaron con Agilent 7890, equipado con detector de masas Agilent 5977 y columna HP-INNOWax (30 m × 0,32 mm × 0,25 μm). Se utilizó helio ultrapuro como gas portador a un caudal constante de 3 ml/min. La temperatura de la caja de la columna se mantuvo inicialmente a 60 °C durante 5 min, se aumentó a 260 °C a una velocidad de 10 °C/min y luego se mantuvo a 260 °C durante 10 min. Las señales de masa características de la glucosa se detectaron en m/z 204 (M + 0), 205 (M + 1), 206 (M + 2), y luego se calcularon en función de la proporción de metabolitos marcados a no marcados, para analizar intermedios relacionados y para detectar la proporción marcada de glucosa en las células por unidad de tiempo.

Para la resecuenciación del genoma completo de SZ3 y SZ17, se aisló el ADN genómico y se analizó su calidad y concentración mediante el sistema Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, EE. UU.) y el fluorómetro Qubit (Thermo Scientific, EE. UU.). Posteriormente, las muestras de ADN cuantificadas se fragmentaron, se hicieron romas, se modificaron con salientes 3ʹ-A, se ligaron a los adaptadores de secuenciación estándar de Illumina y se amplificaron mediante PCR. La biblioteca se secuenció como lecturas de extremos emparejados utilizando un secuenciador Illumina HiSeq 2500. Allwegene Tech (Beijing, China) realizó las construcciones y la secuenciación de bibliotecas. La secuencia de referencia (Synechococcus elongatus PCC 7942, FACHB-805) se obtuvo del GenBank para el mapeo de lectura. Se usó BWA49 para referenciar secuencias y SAMtools50 para ordenar los resultados y marcar lecturas duplicadas. Posteriormente, los SNP y la variación de estructura (SV) entre las secuencias de referencia y las secuencias de muestra fueron identificados por SAMtools y BreakDancer51, respectivamente. Luego, los fragmentos de ADN que contenían SNP y SV se amplificaron a partir del ADN genómico y se verificaron adicionalmente mediante la secuenciación de Sanger.

Células de Synechococcus cultivadas en matraces agitados bajo luz fluorescente blanca de 50 μmol de fotones/m2/s a 30 °C. Las células en la fase logarítmica se recogieron y se resuspendieron a una DO730 de 4. Se añadió actinomicina D (ActD, 5 μg/mL) para bloquear la síntesis de ARNm de novo y se aisló el ARN total en los puntos de tiempo indicados (0, 5, 25 y 45 min) después de agregar ActD utilizando un kit de extracción de ARN bacteriano (Vazyme, Nanjing, China). Luego, las muestras de ARN se transcribieron inversamente en ADNc utilizando HiScript III RT SuperMix para qPCR (Vazyme, Nanjing, China). La RT-PCR cuantitativa se realizó en un detector de secuencias LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza; software LightCycler 480 1.5) basado en fluorescencia SYBR Green I (ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix-Vazyme, Nanjing, China).

Las células de Synechococcus cultivadas hasta el octavo día en condiciones de cultivo estándar (30 °C, 100 µmol de fotones/m2/s, burbujeo de aire para el suministro de carbono) se centrifugaron y lavaron tres veces con una solución salina tamponada con fosfato (Fig. 22 complementaria). Los sedimentos celulares se congelaron en nitrógeno líquido durante 15 min y luego se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Posteriormente, se agregaron 200 µL de ddH2O y 800 µL de una mezcla de acetonitrilo-metanol (1:1) a 80 mg de sedimentos celulares. Después de agitar en vórtice durante 1 min, todas las muestras se almacenaron a -20 °C durante 1 h para la precipitación de proteínas. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12 000 × g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se evaporó a sequedad en un concentrador de vacío. Posteriormente, se añadieron 100 µL de solución de resuspensión (0,1% de ácido fórmico en ddH2O) y se agitó durante 30 s. La solución resultante se filtró a través de una membrana de 0,22 µm. Para garantizar la calidad del análisis metabolómico, se prepararon muestras de control de calidad (QC) mezclando seis réplicas en cada grupo.

Para el análisis de metabolómica no dirigida, las muestras se inyectaron en un equipo de cromatografía líquida de rendimiento ultraalto Agilent 1290 Infinity equipado con una columna Acquity UPLC BEH Amide (2,1 mm × 100 mm, tamaño de partícula de 1,7 µm) y se detectaron con un AB Triple TOF 5600/6600 espectrómetro de masas equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) (AB SCIEX, Canadá). La temperatura de la columna se mantuvo a 25 °C. El gradiente de fase móvil fue una mezcla de acetato de amonio 25 mM y amoniaco 25 mM en agua para la fase móvil A y acetonitrilo para la fase móvil B, a un caudal de 0,30 mL/min. La proporción de fase móvil B se optimizó como 0-0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, 95%–65% B; 7,0–8,0 min, 65%–40% B; 8,0–9,0 min, 40% B; 9,0–9,1 min, 40%–95% B; 9,1–12 min, 95 % B.

Se adoptó un rango de exploración de 50 a 1200 m/z (relación masa-carga) para el análisis de espectrometría de masas (MS). El voltaje de pulverización de iones se fijó en +5 kV para el modo de ionización positivo (ESI+) y -5 kV para el modo negativo (ESI-). La energía de colisión se fijó en +15 y –15 eV para ESI+ y ESI-, respectivamente. Los potenciales de desagrupamiento se establecieron en +60 V (ESI+) y –60 V (ESI–), y la temperatura de la fuente fue de 650 °C. Los datos brutos de LC-MS se convirtieron mediante el software ProteoWizard y se introdujeron en un XCMS para la identificación, coincidencia e integración de picos. Identificación de compuestos de metabolitos por espectros MS/MS con una base de datos interna establecida con estándares auténticos disponibles. Los metabolitos identificados se buscaron adicionalmente en la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto para el análisis de la vía metabólica. Posteriormente, los datos fueron preprocesados ​​por escala de Pareto para el análisis de componentes principales, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA). El análisis estadístico unidimensional incluyó la prueba t de Student y análisis de variación múltiple.

Las células de Synechococcus cultivadas hasta el cuarto día en condiciones de cultivo estándar (30 °C, 100 µmol de fotones/m2/s, burbujeo de aire para el suministro de carbono) se centrifugaron y lavaron con agua libre de DNasa/RNasa (Figura complementaria 23). Los sedimentos celulares se recogieron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido durante 15 min. Se usó reactivo TRIzol (Invitrogen) para la extracción de ARN total de sedimentos celulares congelados (tres réplicas biológicas en cada grupo). La calidad y la concentración del ARN se analizaron con el sistema Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, EE. UU.) y el kit de ensayo Agilent 2100 RAN NANO 6000 (Agilent Technologies, CA, EE. UU.). Las bibliotecas de extremos emparejados se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN (Illumina). El ARNm enriquecido se fragmentó agregando un tampón de fragmentación, y la primera cadena de ADNc se sintetizó usando cebadores de hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa, para lo cual se usaron fragmentos de ARNm como moldes, seguido de la síntesis de ADNc de la segunda cadena usando ADN polimerasa I, RNaseH, tampón y dNTP. A continuación, los fragmentos de ADNc de doble cadena sintetizados se purificaron utilizando un kit de PCR QIAQuick. El ADNc de doble cadena purificado se poliadeniló y se unió con adaptador para preparar la biblioteca de extremos emparejados. El ADNc ligado al adaptador y los cebadores adaptadores se usaron para la amplificación por PCR. Finalmente, se aplicó la plataforma Illumina para secuenciar las bibliotecas de ADNc resultantes y se obtuvieron lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Las lecturas limpias se recortaron de las lecturas sin procesar y todos los análisis posteriores se basaron en las lecturas limpias. Mediante el uso del software Bowtie 2, las lecturas limpias de extremos emparejados se alinearon con el genoma de referencia de Synechococcus elongatus PCC 7942. El número de lecturas correspondientes a cada gen se calculó mediante FeatureCounts52. Posteriormente, se calcularon los fragmentos por kilobase por millón (FPKM) de cada gen en función de la longitud del gen y el recuento de lecturas asignado a este gen. Genes con p-adj <0.05 y |log2foldchange | > log2(1.5) se definieron como genes expresados ​​diferencialmente (DEG).

Los genes Glk1 (Synpcc7942_0221), Glk2 (Synpcc7942_2111) y Fk (Synpcc7942_0116) se amplificaron a partir del genoma PCC 7942 y se clonaron en el pET28a, generando los plásmidos de expresión recombinantes pYW16, pJS89 y pJS90, respectivamente. Los plásmidos recombinantes se transformaron en E. coli cepa BL21 (DE3) para la sobreproducción de proteínas diana. Los transformantes se cultivaron en 500 mL de medio LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina a 37 °C. A una DO600 de 0,6–0,8, las células se indujeron con IPTG 0,3 mM a 16 °C durante 20 h. Después de la inducción, las células se recogieron mediante centrifugación y se rompieron mediante sonicación en tampón de lisis enfriado previamente (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8). Los lisados ​​se centrifugaron a 20 000 × g durante 60 min y los sobrenadantes resultantes se filtraron a través de membranas de polietersulfona de 0,22 μm y luego se cargaron en una columna Ni Sepharose 6 FF (GE Healthcare, Chicago, IL) para la purificación por afinidad. A continuación, se utilizó el procedimiento típico de unión, lavado y elución para obtener las proteínas diana. La concentración de proteínas en las fracciones se determinó mediante el método de Bradford y la pureza de las proteínas diana se examinó mediante SDS-PAGE.

Las actividades de fosforilación de la glucoquinasa y la fructoquinasa en diferentes sustratos de azúcar se midieron usando el ensayo ligado a enzimas de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (PK/LDH) como se describió previamente con modificaciones53. En resumen, se transfirieron 20 µL de la proteína purificada a una placa de 96 pocillos, a la que se agregaron 210 µL de un tampón de reacción (Tris-HCl 100 mM, pH 7,8, ATP 2,5 mM, MgCl2 4 mM, KCl 20 mM, KCl 0,3 mM Se añadió NADP+, azúcar específico 10 mM, PEP 1 mM, PK 1,4 U/mL, LDH 2,8 U/mL) y se midió la absorbancia a 340 nm cada 15 s durante 1 h en la oscuridad. Se calculó la pendiente de A510, que disminuyó con el tiempo, y se compararía la actividad enzimática específica de glucoquinasa/fructoquinasa en cada azúcar con las actividades en glucosa/fructosa para obtener las proporciones relativas.

Para investigar exhaustivamente las secuencias genómicas de glucoquinasa de cianobacterias, descargamos todas las secuencias genómicas de cianobacterias disponibles y su anotación de la base de datos de ensamblaje NCBI utilizando las herramientas de conjuntos de datos NCBI. Se utilizó un total de 986 genomas de cianobacterias de nivel de referencia sin redundancia para construir la base de datos del genoma. La base de datos del genoma se evaluó utilizando la herramienta hmmsearch del paquete Hmmer (versión 3.1b2)54, y se recuperaron secuencias potenciales de glucoquinasa de 947 genomas de cianobacterias para mostrar coincidencias significativas con este HMM de glucoquinasa (PF02685) con valores E < 1–50 (Supplementary Datos 5).

Las células de Synechococcus se recogieron y se resuspendieron con 17 ml de BG11 fresca hasta la OD730 inicial de aproximadamente 2,0. Las tasas de respiración se midieron en la oscuridad durante 200 s a 30 °C y las tasas de evolución de oxígeno fotosintético de cadena completa se midieron durante 160 s en cada nivel de luz (fuente de luz RGB) con el instrumento fotosintético YZQ-201A (Yizongqi Technology Co., Ltd. , China) en presencia de NaHCO3 10 mM. Las tasas de evolución de oxígeno fotosintético total se calcularon como la tasa fotosintética neta más la tasa de respiración.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo y secuenciación del transcriptoma informados en este documento están disponibles a través del registro PRJNA740138 de NCBI BioProject. Todos los datos sin procesar para el análisis de metabolómica no dirigido se han depositado en CNGB Sequence Archive (CNSA)55 de China National GeneBank DataBase (CNGBdb)56 con número de acceso CNP0004406. Los metabolitos identificados se buscaron en la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto [https://www.kegg.jp/kegg/kegg2.html]. La identificación de compuestos a partir de espectros de MS/MS se realizó con una base de datos interna generada a partir de estándares auténticos disponibles. Los archivos de anotación del modelo genético y del genoma de referencia de Synechococcus elongatus PCC 7942 y FACHB-805 se obtuvieron de GenBank [https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/012/525/GCA_000012525. 1_ASM1252v1/]. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los archivos de datos de entrada utilizados para todos los scripts, los archivos de salida generados y el script para el análisis de las secuencias genómicas de glucoquinasa de cianobacterias están disponibles en GitHub [https://github.com/yudifeiluo/cyanobacteria],57.

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La investigación fue apoyada por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Concesión número 2021YFA0909700, para XL y GL), la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil CAS (para GL), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Concesión número 32070084 para GL, 32270103 a GL, 32271484 a XL), el Fondo de Cooperación DNL, ​​CAS (DNL202014, a GL) y la Beca Shandong Taishan (a XL y GL).

Estos autores contribuyeron igualmente: Shanshan Zhang, Jiahui Sun.

Laboratorio clave de biocombustibles, Instituto de bioenergía y tecnología de bioprocesos de Qingdao, Academia de Ciencias de China, No. 189 Songling Road, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan y Xuefeng Lu

Instituto de Energía de Shandong, No. 189 Songling Road, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan y Xuefeng Lu

Laboratorio de Nueva Energía Shandong de Qingdao, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan y Xuefeng Lu

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de la Academia de Ciencias de China, 100049, Beijing, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Huili Sun, Guodong Luan y Xuefeng Lu

Laboratorio Nacional de Energía Limpia de Dalian, Dalian, Liaoning, 116023, China

Guodong Luan y Xuefeng Lu

Laboratorio de Biología Marina y Biotecnología, Laboratorio Nacional de Ciencia y Tecnología Marinas de Qingdao, Qingdao, Shandong, 266237, China

Xuefeng Lu

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GL y XL diseñaron la investigación; SZ, JS, DF, XZ, YW, HS, JC y GL realizaron la investigación; SZ, JS, GL y XL analizaron los datos; y SZ, JS, GL y XL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Guodong Luan o Xuefeng Lu.

Los autores declaran no tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Elton Hudson, Jianping Yu y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, S., Sun, J., Feng, D. et al. Desbloqueo de los potenciales de la fotosíntesis de cianobacterias para convertir directamente el dióxido de carbono en glucosa. Nat Comun 14, 3425 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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Recibido: 07 febrero 2023

Aceptado: 02 junio 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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